吳展興 許林勇

(深圳市第二人民醫(yī)院急診科，廣東 深圳 518035)

一氧化碳(CO)中毒屬于臨床常見的氣體中毒病癥，其造成的死亡率長期居于急性中毒種類的首位。有報(bào)道指出，氧化應(yīng)激是CO中毒后腦損傷的一種重要致病機(jī)制〔1〕。核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子(NRF-2)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類對于氧化應(yīng)激較為敏感的基因轉(zhuǎn)錄性因子，其屬于Keapl-NRF-2/ARE這一抗氧化系統(tǒng)的重要分子。而血紅素加氧酶(HO)-1是一種微粒體酶，在細(xì)胞核組織進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HO-1能夠作為保護(hù)性的蛋白而被誘導(dǎo)，抑制機(jī)體中細(xì)胞因子所介導(dǎo)的相關(guān)凋亡狀態(tài)〔2〕。依達(dá)拉奉屬于新型自由基清除劑，可有效清除活性氧及有細(xì)胞毒性的羥自由基，從而抑制脂質(zhì)的過氧化，避免了血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終抑制了遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞的死亡進(jìn)程。本研究旨在探討依達(dá)拉奉對CO中毒后大鼠腦組織HO-1和NRF-2表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物分組 選擇本院實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的雄性健康清潔級SD大鼠90只，體重200～260 g，平均(234.63±12.33)g。清潔環(huán)境中正常飼養(yǎng)7 d后按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分成對照組、中毒組及治療組各30只。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2模型制作方法 將中毒組及治療組大鼠首先制作CO中毒模型：在密閉的DWC 450-1150動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙(上海701所)中放入大鼠，大鼠呼吸體積分?jǐn)?shù)1 000 ppmin CO氣體40 min，然后追加CO氣體，用體積分?jǐn)?shù)3 000 ppm再處理20 min至大鼠的意識(shí)喪失后，將其移至艙外，即刻用3%的戊巴比妥行腹腔注射麻醉，自左側(cè)的股動(dòng)脈抽取0.3 ml的全血，應(yīng)用產(chǎn)自丹麥雷度公司的ABL800型血?dú)夥治鰞x檢測碳氧血紅蛋白(HbCO)水平。若動(dòng)脈血HbCO≥40%，則表明大鼠中毒模型已制作成功。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用恒溫動(dòng)物毯確保大鼠的體溫為36℃～37℃。

1.3干預(yù)過程 對照組大鼠呼吸1 h新鮮空氣之后腹腔注射3 mg/kg生理鹽水。中毒組及治療組大鼠則在中毒后予以高壓氧治療，1次/d，直到處死。同時(shí)對中毒組大鼠于高壓氧治療之后1 h行等量生理鹽水的腹腔注射，而治療組大鼠則于高壓氧治療之后1 h行10 mg/kg的依達(dá)拉奉腹腔注射，2次/d，直到處死。

1.4免疫組化檢測HO-1及NRF-2陽性細(xì)胞的表達(dá) 分別在干預(yù)1 d、3 d及5 d時(shí)取各組的10只大鼠，將其處死后提取大腦，制成石蠟切片。兔抗大鼠NRF-2及HO-1的單克隆抗體均產(chǎn)自美國的Santa Cruz公司，其一抗的稀釋濃度是1∶100及1∶200。于400倍光鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)亦或細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒時(shí)記為陽性細(xì)胞。用于陰性對照的切片無需添加一抗，并用0.01 mol/L的PBS代替，無陽性反應(yīng)表明一抗特異性較強(qiáng)。對每只大鼠分別測定4張連續(xù)切片，于400倍光鏡下檢測大腦皮質(zhì)區(qū)的4個(gè)隨機(jī)視野，通過德國Leica公司生產(chǎn)的LEICA Qwin圖像處理系統(tǒng)檢測各視野的吸光度值，并計(jì)算平均值。

1.5Western印跡法測定HO-1及NRF-2蛋白的表達(dá) 對各組在干預(yù)1 d、3 d及5 d時(shí)提取的大鼠大腦，選用100 g腦組織經(jīng)RIPA法將總蛋白提取出來，制備出SDS-PAGE凝膠，再加樣電泳，經(jīng)半干法轉(zhuǎn)移到纖維素膜上，使膜浸于含有100 g/L脫脂奶粉TBST封閉液下室溫放置1 h，并放在由TBST配制的NRF-2為1∶550，HO-1為1∶600(均產(chǎn)自美國Santa Cruz公司)的一抗稀釋液及4℃條件下過夜，而后放于HRP標(biāo)記的1∶1 000的二抗稀釋液處于室溫下2 h。將膜放在X光片盒內(nèi)曝光3 min，并顯影40 s，再定影2 min，之后水洗5 min，任一步驟均需充分水洗，防止非特異性的染色。通過Bio-Rad 2000型凝膠成像系統(tǒng)對光片掃描之后，利用Quantity one軟件實(shí)施吸光度值分析。

1.6觀察指標(biāo) 對比各組干預(yù)1 d、3 d及5 d時(shí)腦皮質(zhì)區(qū)HO-1及NRF-2陽性細(xì)胞及蛋白的相對吸光度值，分析CO中毒大鼠腦組織HO-1及NRF-2蛋白表達(dá)的關(guān)系。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腦皮質(zhì)區(qū)HO-1及NRF-2陽性細(xì)胞的相對吸光度值對比 干預(yù)1 d、3 d及5 d時(shí)治療組及中毒組腦皮質(zhì)區(qū)HO-1及NRF-2陽性細(xì)胞的相對吸光度值均高于對照組，且治療組顯著高于中毒組(P<0.05)。治療組及中毒組干預(yù)3 d和5 d時(shí)的HO-1及NRF-2陽性細(xì)胞的相對吸光度值均高于干預(yù)1 d時(shí)，且干預(yù)5 d 時(shí)的水平顯著高于3 d(P<0.05)。見表1。

2.2各組腦皮質(zhì)區(qū)HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值對比 干預(yù)1 d、3 d及5 d時(shí)治療組及中毒組腦皮質(zhì)區(qū)HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值均高于對照組，且治療組顯著高于中毒組(P<0.05)。治療組及中毒組干預(yù)3 d和5 d時(shí)的HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值均高于干預(yù)1 d時(shí)，且干預(yù)5 d時(shí)的水平顯著高于3 d(P<0.05)。見表2。

2.3中毒組及治療組CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白表達(dá)的關(guān)系分析 中毒組及治療組CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白能夠同時(shí)定位在單個(gè)細(xì)胞中，也能在不同細(xì)胞中表達(dá)。見圖1。

表1 各組腦皮質(zhì)區(qū)HO-1及NRF-2陽性細(xì)胞的相對吸光度值對比

與對照組相比：1)P<0.05；與中毒組相比：2)P<0.05；與干預(yù)1 d相比：3)P<0.05；與干預(yù)3 d相比：4)P<0.05，下表同

表2 各組腦皮質(zhì)區(qū)HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值對比

A：HO-1蛋白表達(dá)圖；B：NRF-2蛋白表達(dá)圖；C：共同視野中HO-1及NRF-2蛋白的位置關(guān)系圖1 CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

當(dāng)人體吸入過量CO之后，進(jìn)入體內(nèi)的CO立刻與血紅蛋白相結(jié)合，而后產(chǎn)生HbCO，導(dǎo)致相關(guān)組織發(fā)生缺氧缺血，最終產(chǎn)生各類臨床癥狀。而人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)若缺血缺氧，則可能進(jìn)一步危害腦組織的結(jié)構(gòu)及功能，如神經(jīng)元細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)受損，線粒體的氧化磷酸化等功能變?nèi)趸蛲Ｖ?，從而造成能量代謝過程出現(xiàn)障礙，使得細(xì)胞膜電解質(zhì)代謝紊亂，同時(shí)激發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，最終致使細(xì)胞凋亡而喪失相關(guān)功能〔3，4〕。近年來發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可能與腦損傷之間存在一定聯(lián)系〔5〕。HO是一種微粒體酶，而NFR-2對于氧化應(yīng)激過程則是一類重要的調(diào)節(jié)性因子。由于依達(dá)拉奉可有效地抑制脂質(zhì)的過氧化，保護(hù)血管內(nèi)皮，分析依達(dá)拉奉對于HO-1及NRF-2在CO中毒后大鼠腦組織中的表達(dá)變化，有助于為臨床治療提供數(shù)據(jù)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)，HO-1及NRF-2在CO中毒后大鼠腦組織中的表達(dá)明顯上升，且經(jīng)依達(dá)拉奉治療后二者的表達(dá)水平明顯更高。分析原因，主要是因?yàn)橐肋_(dá)拉奉能夠較好地抑制腦組織細(xì)胞的凋亡過程，而HO-1及NRF-2可能參與此種抑制過程的作用機(jī)制當(dāng)中〔6，7〕。具體而言，正常大鼠腦組織內(nèi)存在較低水平的HO-1及NRF-2蛋白的表達(dá)，此時(shí)機(jī)體能夠維持二者的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯及降解的平衡，同時(shí)調(diào)節(jié)了“氧化-抗氧化”這一系統(tǒng)的相對平衡。而發(fā)生CO中毒之后，HO-1及NRF-2發(fā)生早期激活及高表達(dá)則可能屬于機(jī)體的一種內(nèi)源性和適應(yīng)性的自我保護(hù)機(jī)制，然而此種代償能力相對有限，若不及時(shí)給予治療則會(huì)引起腦組織在中毒后發(fā)生超微結(jié)構(gòu)的損傷和細(xì)胞凋亡，以及相關(guān)神經(jīng)功能的喪失〔8，9〕。由于依達(dá)拉奉的抑制凋亡作用，致使NRF-2自細(xì)胞質(zhì)的分子伴侶Keap1當(dāng)中被分離，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，從而上調(diào)了HO-1和下游基因的相關(guān)表達(dá)，最終使機(jī)體發(fā)揮了更好的抗氧化應(yīng)激能力，而這對CO中毒后的腦損傷過程產(chǎn)生了較好的神經(jīng)保護(hù)作用。相關(guān)報(bào)道指出，依達(dá)拉奉通過促進(jìn)HO-1及NRF-2蛋白的相關(guān)表達(dá)進(jìn)程，參與到Keap1-NRF-2/ARE通路，從而對中毒后腦損傷組織產(chǎn)生了神經(jīng)保護(hù)作用〔10，11〕。

同時(shí)，本文發(fā)現(xiàn)，CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白能夠同時(shí)定位在單個(gè)細(xì)胞中，也能在不同細(xì)胞中表達(dá)。提示HO-1及NRF-2之間并無十分明顯的調(diào)節(jié)關(guān)系，原因可能在于HO-1及NRF-2蛋白可在CO中毒后的腦組織內(nèi)經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)途徑被激活，因此HO-1及NRF-2雖然在中毒后具有一定的協(xié)同表達(dá)，但二者之間并無十分明顯的聯(lián)系〔12，13〕。

綜上所述，HO-1及NRF-2蛋白在CO中毒后大鼠腦組織中的表達(dá)上升，依達(dá)拉奉對于二者表達(dá)具有明顯的提升作用。

1張艷敏，陳惠敏，劉莎莎，等.大株紅景天、依達(dá)拉奉聯(lián)合高壓氧治療急性一氧化碳中毒遲發(fā)腦病療效觀察〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016；25(10)：1113-5.

2趙林巖，李 芳，王蘇平，等.一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病小鼠腦HO-1表達(dá)變化及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系〔J〕.中國臨床解剖學(xué)雜志，2014；32(6)：711-5.

3方建飛，王 芳，徐 杰，等.丁苯酞聯(lián)合依達(dá)拉奉對急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病患者精神狀態(tài)與認(rèn)知功能的影響〔J〕.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016；37(5)：501-5.

4尤 莉，劉曉暉.急性一氧化碳中毒后心肌損害、肺感染、甲襞微循環(huán)相關(guān)性及依達(dá)拉奉早期干預(yù)效果〔J〕.中國急救醫(yī)學(xué)，2016；36(8)：707-11.

5沈美華，孫學(xué)軍，何 建，等.富氫水對大鼠急性一氧化碳中毒腦損傷保護(hù)效應(yīng)的研究〔J〕.中國急救醫(yī)學(xué)，2014；34(5)：446-50.

6Li Q，Cheng Y，Bi M，etal.Effects of N-butylphthalide on the activation of Keap1/Nrf-2 signal pathway in rats after carbon monoxide poisoning〔J〕.Environ Toxicol Pharmacol，2015；40(1)：22-9.

7Kitamoto T，Tsuda M，Kato M，etal.Risk factors for the delayed onset of neuropsychologic sequelae following carbon monoxide poisoning〔J〕.Acute Med Surg，2016；3(4)：315-9.

8Qingsong W，Yeming G，Xuechun L，etal.The free radical scavenger，edaravone，ameliorates delayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide poisoning in rabbits〔J〕.Undersea Hyperb Med，2013；40(3)：223-9.

9劉 磊，蔣小建，樊菲菲，等.依達(dá)拉奉緩解大鼠急性一氧化碳中毒所致腦損傷機(jī)制探討〔J〕.解放軍醫(yī)藥雜志，2016；28(8)：6-9.

10李 琴，程永梅，畢明俊，等.依達(dá)拉奉對一氧化碳中毒后腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2015；14(8)：810-6.

11Li Q，Bi MJ，Bi WK，etal.Edaravone attenuates brain damage in rats after acute CO poisoning through inhibiting apoptosis and oxidative stress〔J〕.Environ Toxicol，2016；31(3)：372-9.

12李 琴，畢明俊，康 海，等.依達(dá)拉奉對急性一氧化碳中毒大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)及抗氧化因子表達(dá)的影響〔J〕.中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2015；22(5)：341-6.

13鄭 然，李 琴，鄒 勇，等.Nrf-2在一氧化碳中毒性腦損傷發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2016；22(21)：4186-9.