李東哲 王丹丹 史 碩 宋妤軒 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

糖尿病性昏迷、腦血管意外等糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥已經(jīng)得到了醫(yī)務(wù)工作者的廣泛關(guān)注，但由糖尿病引發(fā)的認(rèn)知功能障礙，即糖尿病腦病，因其進(jìn)展緩慢，癥狀、表現(xiàn)缺乏特異性而受到了忽視〔1〕。海馬作為邊緣系統(tǒng)的主要組成部分，具有學(xué)習(xí)、記憶和空間定位的作用，與認(rèn)知功能密切相關(guān)〔2〕。在此之前，本研究團(tuán)隊(duì)初步探討了蠶繭水提物——絲膠的抗糖尿病作用，發(fā)現(xiàn)絲膠不僅可以明顯降低2型糖尿病(T2DM)模型大鼠的血糖，還能夠抑制造模大鼠血糖升高〔3〕，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)絲膠能改善糖尿病腎臟功能和生精功能的損傷〔4,5〕。本研究擬分析絲膠灌胃后T2DM模型大鼠海馬生長激素(GH)和生長激素受體(GHR)表達(dá)的變化，以期為糖尿病認(rèn)知功能障礙的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1大鼠分組及處置 將10～12周齡的雄性清潔級SD大鼠(購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號712024)，隨機(jī)分組，每組12只：①空白對照組，大鼠不給予任何處置，可以自由進(jìn)食；②T2DM模型組，制備T2DM大鼠模型，造模后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處理；③絲膠組，制備T2DM大鼠模型，造模后在常規(guī)飼養(yǎng)的同時(shí)用2.4 g/kg的絲膠1次/d灌胃治療35 d。

絲膠的獲取及使用方法：承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供彩色蠶繭，將蠶繭用純水浸泡后煎煮2次，過濾后合并2次的濾液，濃縮至所需濃度，4℃冰箱保存，灌胃前用37℃水浴箱復(fù)溫。

1.2大鼠T2DM模型的建立 用pH 4.4的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，在臨用時(shí)配制鏈脲佐菌素(streptozotocin，購自美國Sigma公司)溶液，濃度是2%，給予大鼠腹腔連續(xù)注射3 d(25 mg·kg-1·d-1)。1 w后以大鼠血糖(BG)≥16.7 mmol/L作為模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3處死大鼠、取材、檢測相關(guān)指標(biāo) 配制4%的水合氯醛，以腹腔注射的方式麻醉大鼠，用毛細(xì)玻璃管從眼內(nèi)靜脈叢采集大鼠空腹靜脈血。然后斷頭處死大鼠，在冰盤上迅速剝離腦組織并取雙側(cè)海馬，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

1.3.1測定大鼠血液參數(shù) 血液標(biāo)本3 000 r/min、離心20 min，取上層血清，BG采用葡萄糖氧化酶法，采用ELISA法檢測GH水平(GH ELISA試劑盒，購自美國Rb公司)。

1.3.2檢測大鼠海馬GH和GHR的表達(dá) (1)Weston印跡法檢測GH和GHR蛋白的表達(dá)：提取海馬組織中總蛋白；應(yīng)用BCA蛋白試劑盒(購自北京泰格美科技有限公司)定量，蛋白上樣量100 μg；15% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉封閉過夜；4℃搖床孵育一抗〔GH 1∶200(小鼠抗大鼠單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司)，β-actin 1∶1 000(小鼠抗大鼠單克隆抗體，購自美國Abcam公司)，GHR 1∶100(兔抗大鼠多克隆抗體，購自上海滬峰化工有限公司)〕過夜；室溫下?lián)u床孵育二抗〔山羊抗小鼠、兔IgG 1∶5 000(購自美國Sigma公司)〕2 h；應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)超敏發(fā)光液進(jìn)行顯影；應(yīng)用EPSON掃描儀掃描膠片，應(yīng)用Quantity One-v 4.6.2軟件對目標(biāo)條帶的灰度值進(jìn)行分析，以目標(biāo)條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值作為GH和GHR蛋白的相對表達(dá)水平。(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)檢測GH和GHR mRNA的表達(dá)：提取海馬組織總RNA；鑒定RNA的完整性，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30℃加熱10 min；55℃加熱30 min；99℃加熱5 min；5℃冷卻5 min；終止反應(yīng))；對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增(PCR引物序列及擴(kuò)增條件見表1)；取擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)；應(yīng)用ZF型紫外透射反射分析儀進(jìn)行攝像，應(yīng)用Quantity One-v 4.6.2軟件對目標(biāo)條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)條帶光密度值/內(nèi)參照條帶光密度值作為GH和GHR mRNA的相對表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，組間的兩兩比較采用SNK法。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增條件

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠BG和血清GH水平比較 與空白對照組大鼠相比，T2DM模型組大鼠的BG和血清GH水平明顯升高(P<0.05)；絲膠能明顯降低T2DM模型大鼠的血糖和血清GH水平(P<0.05)。見表2。

2.2三組大鼠海馬GH和GHR表達(dá)情況比較 與空白對照組大鼠相比，T2DM模型組大鼠海馬GH蛋白和mRNA的表達(dá)水平明顯升高，GHR蛋白和mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與T2DM模型組大鼠相比，絲膠組大鼠海馬GH蛋白、mRNA的表達(dá)水平明顯降低，GHR蛋白、mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表3，圖1，圖2。

表2 各組大鼠的BG和血清GH水平

與T2DM模型組比較：1)P<0.05，下表同

表3 各組大鼠海馬GH和GHR的表達(dá)比較

1.空白對照組，2.T2DM模型組，3.絲膠組；下圖同圖1 各組大鼠海馬GH和GHR蛋白的表達(dá)

3 討 論

GH是由腺垂體分泌的含有191個(gè)氨基酸的肽類激素，具有促進(jìn)生長發(fā)育、調(diào)節(jié)新陳代謝及機(jī)體多種生理功能的作用，在哺乳動(dòng)物GH還參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)〔6〕。GH發(fā)揮作用的方式包括直接作用于靶細(xì)胞發(fā)揮作用；由胰島素樣生長因子(IGF)家族介導(dǎo)，通過GH/IGFs軸發(fā)揮作用；依賴JAK2激活的信號通路，其中JAK2-STAT5是GH誘導(dǎo)的改善代謝功能、促進(jìn)機(jī)體生長的核心通路〔7〕；不依賴JAK2激活的信號機(jī)制，如GH可激活Src和ERK1/2，從而發(fā)揮相應(yīng)的生理功能〔7〕。無論是哪一種方式，GH都需要首先與靶細(xì)胞膜表面的GHR結(jié)合，通過GHR介導(dǎo)，以不同的方式將信號傳入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮GH的生理作用。有研究顯示，GHR的含量、功能等均可影響GH生理功能的發(fā)揮〔8〕。在GH發(fā)揮作用的方式中，GH-GHR/IGF-1軸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用逐步得到了學(xué)者們的關(guān)注。

目前，海馬被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵區(qū)域，而對于嚙齒類動(dòng)物來說，海馬是空間學(xué)習(xí)的基本結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)，不論1型糖尿病還是T2DM，均存在GH-GHR/IGF-1軸異常，且與糖尿病(DM)海馬損傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)〔9，10〕。DM時(shí)，高BG狀態(tài)降低了下丘腦對葡萄糖的調(diào)節(jié)作用，從而減弱了葡萄糖對GH分泌的抑制作用，進(jìn)而使GH水平升高〔11〕。DM伴隨GH升高的情況下，不但更加難以控制BG，而且還會(huì)影響DM慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展；并且，過多的GH還能抑制GHR的表達(dá)，揭示了GH和GHR之間的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)也提示了組織對GH的敏感性降低，因此導(dǎo)致了GH作用減弱〔12〕。而敲除或下調(diào)GHR的表達(dá)水平，可通過GH抵抗使IGFs介導(dǎo)的GH的多種作用減弱，在海馬表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡增加，認(rèn)知功能下降〔13，14〕。

中醫(yī)認(rèn)為DM屬于“消渴病”，病因比較復(fù)雜，先天稟賦不足是重要內(nèi)因；長期飲食不節(jié)、積熱，情志失調(diào)，勞欲過度、腎精虧損，終致腎虛肺燥而發(fā)消渴，治療原則是清熱生津、滋陰潤燥、養(yǎng)陰益氣?！侗静菥V目》記載，蠶繭“煮湯治消渴，古方無他”。中醫(yī)認(rèn)為蠶繭性味甘、溫，和緩，溫而不燥，補(bǔ)而不膩，以血肉友情之身，善補(bǔ)至虛至損之精氣?，F(xiàn)代藥理研究證明蠶絲纖維中的絲膠有擬膽堿作用，并含鐵、氟、錳、鋅等微量元素，降糖解渴、治小便過多，民間亦有蠶繭泡水降BG的驗(yàn)方。本課題組前期觀察了絲膠對T2DM模型大鼠腎臟損傷和生精功能障礙的保護(hù)作用〔5，6〕。本研究結(jié)果提示絲膠可能通過調(diào)節(jié)DM時(shí)海馬GH和GHR的表達(dá)，進(jìn)而通過改善海馬GH-GHR/IGF-1軸的功能改善學(xué)習(xí)記憶能力，但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

本研究中使用的絲膠，為蠶繭中占25%～30%的水溶性蛋白，但在繅絲的時(shí)候被丟棄，造成了巨大的浪費(fèi)。本課題組對絲膠抗DM的研究，不但可為臨床治療DM提供新思路，也可以避免浪費(fèi)大量優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，對蠶業(yè)產(chǎn)品的有效利用及新產(chǎn)品的開發(fā)將具有較好的促進(jìn)作用。

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