金美英 樸春麗 趙宗江 米 佳 劉向榮 陳 曦

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 133021)

理想的糖尿病動(dòng)物模型是研究糖尿病的有力工具，在2型糖尿病(T2DM)的科研中起著重要的作用。國(guó)內(nèi)相關(guān)ZDF大鼠模型制備研究較少，并且國(guó)際上不同的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的時(shí)間和條件不同，成模的情況也不一致。本課題通過(guò)Purina #5008飼養(yǎng)9周齡雄性ZDF大鼠，誘導(dǎo)人類T2DM機(jī)制，制備自發(fā)性T2DM動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)分析ZDF大鼠體重與血糖的變化,對(duì)ZDF大鼠T2DM模型的穩(wěn)定性及持續(xù)性進(jìn)行分析，試圖摸索出最佳成模時(shí)間。T2DM的兩個(gè)發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能減退。中醫(yī)藥對(duì)于T2DM的發(fā)生和控制T2DM的進(jìn)展有獨(dú)特的見解，解毒通絡(luò)調(diào)肝方是根據(jù)中醫(yī)“毒損絡(luò)脈”病機(jī)，從“肝”論治糖尿病理論結(jié)合臨床實(shí)踐確立的治療T2DM的大法，在T2DM的臨床應(yīng)用中顯示出良好的療效〔1～3〕。因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)ZDF T2DM動(dòng)物模型的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與飼料 SPF級(jí)健康、雄性9周齡Zucker Diabetes Fat(ZDF)大鼠88只，SPF級(jí)健康、雄性9周齡Zucker Lean(ZL)大鼠10只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK京 2014-0003)。高脂飼料Purina #5008〔購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào) SCXK(京) 2009-0008〕，實(shí)驗(yàn)大鼠置于潔凈動(dòng)物櫥(北京文慧凈化設(shè)備廠制造，專利號(hào)：EJ932041477)中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(23～25)℃，相對(duì)濕度50%～60%，每日12 h光照維持，所有大鼠自由飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 治療藥為解毒通絡(luò)調(diào)肝方(由榛花15 g、大黃30 g、黃連15 g、雙花15 g、黃芪30 g、丹參15 g、柴胡10 g組成，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，4℃冰箱保存)；對(duì)照藥為鹽酸二甲雙胍片(天津太平洋制藥有限公司，批號(hào) 080313)。

1.3動(dòng)物模型的建立 88只9周齡雄性ZDF大鼠以Purina #5008飼養(yǎng)，10只9周齡雄性ZL大鼠以維持飼料#1022飼養(yǎng)。動(dòng)態(tài)觀察隨機(jī)血糖及體質(zhì)量的變化，以隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L作為T2DM成模標(biāo)準(zhǔn)〔4〕，第5周及第8周各隨機(jī)抽取10只、15只ZDF大鼠測(cè)量隨機(jī)血糖水平。飼養(yǎng)第10周對(duì)88只ZDF大鼠進(jìn)行隨機(jī)血糖監(jiān)測(cè)，根據(jù)血糖水平分為<11.1 mmol/L、11.1～16.9 mmol/L、>16.9 mmol/L三種血糖梯度，然后將大鼠重新分籠飼養(yǎng)，第11周對(duì)血糖濃度<11.1 mmol/L的大鼠再次進(jìn)行隨機(jī)血糖監(jiān)測(cè)，選出符合成模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，并將第10周及第11周已符合成模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠重新隨機(jī)分組飼養(yǎng)，至第12周將已成模大鼠及未成模大鼠再次進(jìn)行隨機(jī)血糖監(jiān)測(cè)，判斷其模型的穩(wěn)定性。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 造模前將ZL大鼠(10只)設(shè)為對(duì)照組； ZDF大鼠(88只)設(shè)為造模組，飼養(yǎng)誘導(dǎo)制備T2DM動(dòng)物模型。第13周將ZL大鼠與已成模的ZDF大鼠進(jìn)行分組，ZL(10只)大鼠作為正常組；成模ZDF大鼠按血糖水平隨機(jī)分為5組，模型組(15只)，鹽酸二甲雙胍(西藥)組(11只)，解毒通絡(luò)調(diào)肝方大小劑量組，每組各11只。

1.5給藥 飼養(yǎng)第13周開始進(jìn)行藥物灌胃，模型組與正常組以等體積蒸餾水灌胃，1次/d，西藥組：臨用前將二甲雙胍攪拌至完全溶解，用蒸餾水稀釋，給藥劑量為0.5 g/kg，1次/d。解毒通絡(luò)調(diào)肝方小、中、大劑量組：蒸餾水稀釋，灌胃劑量為1、3、5 g/kg，按所含原藥材量計(jì)算，1次/d。灌胃時(shí)間均為每日上午9：00，治療周期為4 w。觀察大鼠一般狀態(tài)，每周稱量記錄體質(zhì)量。

1.6觀察指標(biāo) 開始飼養(yǎng)后每周進(jìn)行一次稱重觀察體質(zhì)量變化情況，飼養(yǎng)期間結(jié)合一般狀態(tài)在第5、8、10、11、12、17周均進(jìn)行隨機(jī)血糖的監(jiān)測(cè)。藥物灌胃結(jié)束后第17周禁食12 h，各組大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉。經(jīng)股動(dòng)脈取血，加入10 ml干凈離心管，靜置2 h后，2 500 r/min低溫高速離心20 min，抽取上層血清，檢測(cè)血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的變化。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS20.0 軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物模型制備 ZL大鼠精神狀態(tài)好，動(dòng)作靈敏好動(dòng)，毛發(fā)有光澤。ZDF大鼠剛進(jìn)入動(dòng)物房的前幾周活動(dòng)靈活，隨著周齡增加體質(zhì)量逐漸增大〔造模第0、11、17周體質(zhì)量分別為(262.78±3.70)、(447.00±4.06)、(458.93±8.96)g，第11、17周體質(zhì)量與第0周比較差異顯著(P<0.05)〕，形體變胖，毛色逐漸枯黃無(wú)光澤，漸漸開始懶惰，逐漸萎靡不振，逐步出現(xiàn)三多癥狀。在血糖方面，第5周〔(10.37±4.35)mmol/L〕與第8周〔(12.14±4.90)mmol/L〕比較有逐漸升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；飼養(yǎng)第10周出現(xiàn)并發(fā)癥傾向，測(cè)隨機(jī)血糖〔(15.30±7.12)mmol/L〕與第8周比較均有顯著性升高(P<0.05)，符合成模標(biāo)準(zhǔn)54只，血糖<11.1 mmol/L的34只；第11周對(duì)未成模的34只ZDF大鼠復(fù)查血糖，符合成模標(biāo)準(zhǔn)20只，血糖<11.1 mmol/L的14只；經(jīng)第10周與第11周兩次篩查符合成模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠73只(82.95%，共74只，死亡1只)，第11周(已成模)血糖均值為(18.18±5.47)mmol/L，繼續(xù)飼養(yǎng)第12周復(fù)查血糖有小幅度升高，但與第11周(已成模)比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。第12周(未成模)〔(9.52±1.16)mmol/L〕與第11周(未成模)〔(9.02±0.99)mmol/L〕比較也無(wú)顯著差異(P>0.05)。第17周(模型組)隨機(jī)血糖〔(24.27±6.38)mmol/L〕進(jìn)行性升高，與第12周(已成模)〔(18.76±5.27)mmol/L〕比較，有顯著性升高(P<0.01)。9周齡雄性ZDF大鼠以Purina #5008飼養(yǎng)誘導(dǎo)11 w，符合2型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠達(dá)到82.95%，繼續(xù)以Purina #5008飼養(yǎng)，經(jīng)12 w、17 w反復(fù)復(fù)查隨機(jī)血糖，證明其穩(wěn)定性及持續(xù)性，得出9周齡雄性ZDF大鼠以Purina #5008飼養(yǎng)11 w誘導(dǎo)T2DM動(dòng)物模型成模率較高，持續(xù)性及穩(wěn)定性較好。ZDF大鼠飼養(yǎng)成模后，11 w與12 w已成模大鼠死亡2只，14 w模型組死亡1只，共死亡3只，ZDF大鼠死亡率為3.4%。ZL對(duì)照組大鼠無(wú)死亡。

2.2解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)各組大鼠體質(zhì)量的影響 與正常組比較，模型組、西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方大、中、小劑量組體質(zhì)量有顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方大、中、小劑量組體質(zhì)量有下降趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)各組大鼠體質(zhì)量的影響

與正常組比較:1)P<0.01

2.3解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)各組大鼠糖代謝的影響 與正常組比較，模型組、西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方大、中、小劑量組GLU、HbA1c、胰島素(INS)顯著升高(P<0.01)；西藥組與解毒通絡(luò)調(diào)肝方大劑量組GLU明顯低于模型組(P<0.05)，西藥組與大劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；西藥組、中劑量組GSP低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.4解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)兩組大鼠脂代謝的影響 與正常組比較，模型組、西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方大、中、小劑量組TC、TG、HDL-C均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方大、中、小劑量組TC、HDL-C下降明顯(P<0.01，P<0.05)，大劑量組、西藥組與模型組比較TG下降明顯(P<0.05)；與西藥組比較，解毒通絡(luò)調(diào)肝方大劑量組TC、TG、HDL-C下降明顯(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)糖、脂代謝的影響

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01；與西藥組比較：4)P<0.05,5)P<0.01

3 討 論

糖尿病是一種由多源性病因引起的疾病，受社會(huì)因素、遺傳因素、生活方式因素及環(huán)境因素等影響。

糖尿病中醫(yī)稱之為消渴病，以“毒邪”理論與“絡(luò)病”理論為契機(jī)，“毒損絡(luò)脈”為病機(jī)切入點(diǎn)，結(jié)合“肝臟”在消渴病發(fā)病中的作用，提出從“肝”論治糖尿病〔3～5〕，以解毒通絡(luò)調(diào)肝法為治療大法，方中選榛花、大黃為君藥，重在解毒，活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)，祛濁化濕；黃連、雙花清熱解毒，燥濕祛濁；黃芪、丹參益氣通絡(luò)，疏通經(jīng)絡(luò)，扶正祛邪，共同增強(qiáng)君藥解毒作用均為臣藥；柴胡引藥入肝經(jīng)，疏利氣機(jī)，為佐使藥。全方攻補(bǔ)兼施、扶正祛邪，激活機(jī)體的排毒能力，通絡(luò)以通暢絡(luò)脈、推陳出新，調(diào)肝以調(diào)暢氣機(jī)，求其平衡，乃正本求源之大法。解毒通絡(luò)調(diào)肝方在T2DM的臨床應(yīng)用中顯示出良好的療效〔3～5〕。

目前，ZDF大鼠被公認(rèn)為是先天遺傳性T2DM和肥胖病模型動(dòng)物，雄性ZDF大鼠必須經(jīng)過(guò)Purina #5008特殊飼料誘導(dǎo)，才能出現(xiàn)高INS血癥和高血糖癥〔6〕，有報(bào)道稱，Purina#5008飼料飼養(yǎng)條件下，雄性ZDF大鼠一般情況下6 w顯現(xiàn)高INS血癥；7 w開始顯現(xiàn)高血糖，10 w發(fā)展為糖尿病(DM)，隨著DM的發(fā)展，12 w逐步出現(xiàn)INS分泌障礙〔7〕。雌性ZDF大鼠在Purina#5008飼喂下不發(fā)展為DM〔8,9〕。ZL大鼠是非肥胖且非DM的模型動(dòng)物，外表與ZDF大鼠相似，經(jīng)常被用來(lái)作為ZDF大鼠的對(duì)照組模型動(dòng)物。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) ZDF大鼠以Purina #5008飼養(yǎng)后第1～3周體質(zhì)量增長(zhǎng)迅速，飼喂第3周之后體質(zhì)量增長(zhǎng)放緩，隨著周齡的增加，ZDF大鼠與ZL大鼠體重相差明顯。ZDF大鼠Purina #5008飼養(yǎng)后由糖耐量異常逐步發(fā)展為高血糖狀態(tài)，第11周成模率較高，已成模大鼠在第12、17周持續(xù)存在高血糖狀態(tài)，同時(shí)隨機(jī)血糖有進(jìn)一步升高趨勢(shì)，可排除應(yīng)激性血糖升高可能性，從而證明ZDF大鼠T2DM動(dòng)物模型的穩(wěn)定性及持續(xù)性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)ZDF大鼠T2DM動(dòng)物模型除了高血糖還具有高INS血癥、高TC血癥及高TG血癥等特征，符合人類T2DM相關(guān)特征，造模后模型的穩(wěn)定性及持續(xù)性較好，同時(shí)死亡率較低，安全性較好，是理想的T2DM動(dòng)物模型。解毒通絡(luò)調(diào)肝方干預(yù)后，可降低血糖、調(diào)節(jié)血脂，從而控制T2DM發(fā)生、發(fā)展，為深入研究解毒通絡(luò)調(diào)肝方治療T2DM療效機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中醫(yī)“毒損絡(luò)脈”理論研究及從“肝”論治T2DM的臨床應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1樸春麗,楊叔禹,仝小林,等.解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肝臟IRS表達(dá)的影響〔J〕.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2009;22(14):1176-9.

2于 淼,樸春麗,南 征.解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟NF-κB及MCP-1表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2010;30(8):2306-7.

3于 淼,樸春麗,南 征.2型糖尿病胰島素抵抗從毒損肝絡(luò)論治的理論初探〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志,2007;41(3):18-20.

4Matteucci E，Giampietro O.Proposal open for discussion:defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research〔J〕.J Ethnopharmacol，2008;115(2):163-72.

5潘長(zhǎng)玉.糖尿病學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：5-6.

6William TC.Animal modeles of type 2 diabetes clinical presentation and pathophysiological relevance to human condition〔J〕.ILMU，2006;47(3):186-7.

7Pick A，Clark J，Kubstrup C，etal.Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat〔J〕.Diabetes，1998;47(3)：358-64.

8Huang TH,Peng G,Kota BP,etal.Anti-diabetic action of Punica granatum flower extract:activation of PPAR-g and identification of an active compound〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol,2005;207(2):160-9.

9Coimbra TM,Janssen U,Grone HJ,etal.Early events leading to renal injury in obese Zucker(fatty) rats with typeⅡ diabetes〔J〕.Kidney Int,2000;57(1):167-82.