吉福玲，金智生，吳國泰，何 流，王 棟，韓衛(wèi)強(qiáng)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy ,DPN)是糖尿病的常見并發(fā)癥，可引起疼痛，甚至壞疽，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,而其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。探索建立適當(dāng)?shù)腄PN動物模型，不僅能推進(jìn)DPN的病因及發(fā)病機(jī)制的研究，還能為臨床治療提供指導(dǎo)。筆者在查閱國內(nèi)外關(guān)于DPN動物模型建立的相關(guān)文獻(xiàn)后，按不同造模原理及造模的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行綜述，以期能為糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)研究工作提供參考。

1 高脂飲食加腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)模型

高糖高脂飲食誘導(dǎo)動物胰島素抵抗后，再注射低劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)部分損傷胰島細(xì)胞，引起血糖升高，可模擬2型糖尿病的發(fā)病過程并大大縮短了建模的周期。

1.1 Sprague-Dawley大鼠DPN模型

STZ是一種通過破壞β細(xì)胞DNA進(jìn)一步減少胰島素分泌的廣譜抗菌藥，可破壞胰腺功能，最終形成糖尿病。在致病過程中，STZ僅致胰島素分泌減少，模型動物可存活較長時間，死亡率較低，成本不高，費(fèi)時少，易操作；但此方法不能阻止動物長期自發(fā)再生胰島B細(xì)胞；因此模型不夠穩(wěn)定，不能用于長時間研究，且STZ對重要臟器具有毒性作用。在實(shí)驗(yàn)中多為短時，且低劑量腹腔注射。屈璐等[2]采用清潔級SPF雄性Sprague-Dawley(SD)健康大鼠，成年雄性，飲食誘導(dǎo)和注射STZ兩步法制作糖尿病神經(jīng)病變模型。給予高脂高能飲食3周后，分別給予劑量為20，30 μg/g STZ 腹腔注射, 測得大鼠血糖值≥16.7 mmol/ L，冰敷大鼠坐骨神經(jīng)解剖位置，12周后檢測大鼠坐骨神經(jīng)出現(xiàn)病理改變，則認(rèn)為DPN模型成功。殷娟等[3]、Dong HY等[4]認(rèn)為在給予高脂飲食喂養(yǎng)4周后，給以劑量為25，40 μg/g STZ腹腔注射，測得血糖 16.7 mmol/L以上，8周后檢測坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低并有脫髓鞘病理變化，認(rèn)為造模成功。秦超超[5]給予SD大鼠高脂飲食8周后給予劑量為20 μg/g 的STZ腹腔注射，以空腹血糖>11.1 mmol/L、胰島素抵抗>1.20雙重指標(biāo)為大鼠DPN模型成功標(biāo)準(zhǔn)。李慶蓉[6]在SD成年雄性健康大鼠高脂飲食4周后給予腹腔注射STZ 25 μg/g ，第8周再次注射STZ 35 μg/g，認(rèn)為血糖>13.8 mmol/L為糖尿??；普通飲食喂養(yǎng)12周，測得神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，則DPN模型建立。以上研究顯示：高脂飲食配合低劑量STZ腹腔注射造模，成功率高，模型鼠死亡率低。

1.2 昆明小鼠DPN模型

董涵宇[7]喂昆明小鼠高脂高糖飼料4周，給予一次性腹腔注射STZ 150 μg/g，8周后認(rèn)為DPN小鼠造模成功，未進(jìn)行血糖及神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測。穆曉紅等[8]將雄性昆明小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8周后，給予STZ 45 μg/g 腹腔注射，血糖>16.7 mmol/L并穩(wěn)定 3 d 者認(rèn)為造模成功。

1.3 Wistar大鼠DPN模型

有研究者采用清潔級雄性Wistar大鼠，高脂、高糖飼料喂養(yǎng)6周，腹腔注射STZ 30 μg/g，測血糖≥16.7 mmol/L認(rèn)為造模成功。多未測坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。李凌雁等[9]研究采用雄性Wistar大鼠高脂飼料喂養(yǎng)至第8周時將STZ 30 μg/g腹腔單次注射，測血糖>16.7 mmol/L，8周后檢測坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著減慢即為糖尿病周圍神經(jīng)病變造模成功。渠勝英等[10]高脂、高糖喂養(yǎng)大鼠6周，腹腔注射STZ 30 μg/g，血糖大于16.7 mmol/L后測神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，視為造模成功。

2 單純腹腔注射STZ誘導(dǎo)DPN模型

2.1 SD大鼠DPN模型

亦有學(xué)者采用單純腹腔注射STZ誘導(dǎo)建立DPN模型。邱有波等[11]和元榮榮[12]均采用清潔級健康成年SD大鼠(雌雄不限)，以腹腔注射STZ 60 μg/g 建立DPN模型。注射 3 d后尾靜脈采血，測血糖≥15 mmol/L 確定為糖尿病模型；繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng) 4周，邱有波等將空腹血糖>15 mmol/L、坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢、擺尾溫度閾值升高認(rèn)為DPN大鼠模型制備成功；而元榮榮將血糖>16.7 mmol/L、坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢、擺尾溫度閾值升高認(rèn)為 DPN 大鼠模型制備成功。

趙偉成等[13]與鄭小蘭[14]給SD大鼠腹腔注射STZ 60 μg/g，測血糖>16.7 mmol/L，并同時采用不同標(biāo)號的von Frey纖維絲刺激大鼠引起機(jī)械縮足反應(yīng)，閾值(PWT) >50%的定為大鼠糖尿病痛性周圍神經(jīng)病變造模成功。

胡明財(cái)?shù)萚15]與謝勤[16]將 STZ 55 μg/g 給予 SPF級雄性SD大鼠腹腔注射，3 d 后，血糖>16.7 mmol/L大鼠、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯降低即制成DPN大鼠模型。栗明等[17]采用雄性SD大鼠腹腔注射STZ 70 μg/g，3 d 后測血糖,將血糖≥16.7 mmol /L的大鼠常規(guī)飼養(yǎng)10周，將坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢、結(jié)周脫髓鞘、軸突萎縮者視為DPN模型建立成功。

2.2 Wistar大鼠DPN模型

單純腹腔注射除SD大鼠外，有研究者采用Wistar大鼠建模。冷錦紅等[18]采用健康雄性Wistar大鼠腹腔注射 STZ 53 μg/g ，齊月[19]建模方式與其基本相同。給藥 3 d 后將血糖>16.7 mmol/L者進(jìn)行普通飼養(yǎng)4周，將大鼠后足的機(jī)械性痛閾值下降50%者認(rèn)為DPN造模成功。張翔[20]的造模方法與侯英等[21]相似，均以STZ 60 μg/g 腹腔注射，將血糖持續(xù)>16.7 mmol/L的大鼠視為造模成功。筆者認(rèn)為此種造模僅僅為糖尿病模型，未進(jìn)行任何有關(guān)神經(jīng)方面的檢測，將其歸為DPN模型建立，有失科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。在STZ腹腔注射劑量方面，王宏英等[22]以Wistar大鼠腹腔注射STZ 55 μg/g，將血糖≥16.7 mmol/L的大鼠視為糖尿病大鼠，之后觀察8周，就認(rèn)為DPN模型建立，也無活體神經(jīng)檢測結(jié)果。

3 c57BL/6J小鼠DPN模型

國外研究中有以c57BL/6J 小鼠高脂飲食喂養(yǎng)及腹腔注射STZ誘導(dǎo)建立DPN模型的方法。如Yorek MS 等[23]以高脂飲食喂養(yǎng)c57BL/6J小鼠8周后，腹腔注射STZ 75 μg/g 后再次給予50 μg/g 腹腔注射，測血糖>13.8 mmol/L,12周后用Hargreaves method進(jìn)行行為學(xué)測試，作為DPN模型建立的標(biāo)準(zhǔn)。Lawrence Coppey等[24]實(shí)驗(yàn)中直接腹腔注射STZ 150 μg/g，測血糖>16.7 mmol/L，12周后測神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度減慢認(rèn)為DPN模型建立。

4 自發(fā)性小鼠DPN模型

4.1 自發(fā)性KK/Upj-Ay小鼠DPN模型

張會欣等[25]觀察到KK小鼠12 周齡時，就具有高血糖、高度胰島素抵抗的特點(diǎn)，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢；光鏡觀察到部分坐骨神經(jīng)軸索退變、崩解，軸索與髓鞘混為一體；電鏡觀察到毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹，神經(jīng)纖維板層局部增厚，軸索變細(xì)甚至軸索閉鎖，無髓神經(jīng)纖維空化等。表明KK/Upj-Ay小鼠出現(xiàn)了明顯的周圍神經(jīng)損害,符合DPN的病理特點(diǎn)。提示KK/Upj-Ay小鼠出現(xiàn)了DPN，為DPN的研究提供了新的模型。

4.2 自發(fā)性db/db小鼠及ob/ob小鼠

國內(nèi)外研究者認(rèn)為：目前db/db小鼠和ob/ob小鼠也可建立理想的DPN模型。db/db小鼠是由于瘦素受體基因缺陷導(dǎo)致的先天肥胖性T2DM小鼠，在出生后2周內(nèi)就發(fā)生高胰島素血癥，8周后就發(fā)展為非常嚴(yán)重的高血糖癥，期間伴有胰島素抵抗，β細(xì)胞功能衰竭。劉芳等[26]研究認(rèn)為自發(fā)性糖尿病小鼠血清中IL-10的水平高于誘發(fā)性2型糖尿病小鼠，而IL-10在糖尿病并發(fā)癥發(fā)展過程中起保護(hù)性作用，為實(shí)驗(yàn)室研究提供了明確的研究指標(biāo)；而且與誘發(fā)性糖尿病小鼠模型相比，db/db小鼠和ob/ob小鼠由于不存在人為誘導(dǎo)因素的干擾，與糖尿病的產(chǎn)生和臨床患者具有高度的相似性，比較適合建立DPN模型，對臨床指導(dǎo)更有意義。國外研究者認(rèn)為ob/ob小鼠11周齡即可出現(xiàn)糖尿病周圍神經(jīng)病變[27]，但其價(jià)格昂貴，不適合大樣本實(shí)驗(yàn)研究。

5 討 論

目前國內(nèi)外糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的大幅度增長趨勢急待臨床工作者尋找出有效的、先進(jìn)的治療方案，因此理想的動物模型的探索勢不可擋；但目前仍無一種公認(rèn)的理想的DPN造模方法。實(shí)驗(yàn)性DPN動物模型的建立有幾種，但均為自我實(shí)驗(yàn)的摸索，不具普適性。在以上的幾種建模方法中，有共性也有個性：實(shí)驗(yàn)動物不同，但所用化學(xué)誘導(dǎo)藥物相同，劑量也已無較大差別。誘導(dǎo)藥物的化學(xué)毒性要求實(shí)驗(yàn)者嚴(yán)格掌握使用劑量。文獻(xiàn)報(bào)道中，STZ誘導(dǎo)的模型出現(xiàn)周圍神經(jīng)病變的時間在8～12周之間，以坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢、甩尾潛伏期和熱縮足潛伏期縮短、機(jī)械性痛閾降低、痛覺傳導(dǎo)時間延長、平均步行周期顯著延長、四足支撐時長[28-31]作為糖尿病周圍神經(jīng)病變模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)，且成模率高，死亡率低。目前，在探索建立2型糖尿病動物模型過程中存在應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因敲除技術(shù)建立的基因動物模型，但因其局限性目前在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較少。在實(shí)際操作過程中，研究者必須依據(jù)人力、物力、財(cái)力，以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡葋磉x擇合適的造模方式；應(yīng)在吸取現(xiàn)有造模經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)造模基本原理，根據(jù)自己所需探索更為縝密的模型?？茖W(xué)技術(shù)的發(fā)展離不開人類的創(chuàng)新，相信實(shí)驗(yàn)性糖尿病周圍神經(jīng)病變動物模型的制作將會在不斷的研究、探索中取得進(jìn)步。

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