崔琳 李萌 鄒笑然 張春陽

摘 要 電化學傳感器具有簡便、快速、靈敏、成本低、易于微型化、可在線檢測等優(yōu)點，在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品安全領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的電化學傳感器存在穩(wěn)定性差和重現(xiàn)性差等不足。比例電化學傳感器基于一對雙信號轉(zhuǎn)換模式，以兩種或兩種以上電化學活性分子的電信號比值作為輸出信號。由于同一體系中的兩種或多種電活性物質(zhì)的電信號常會受到相似的外界環(huán)境影響，采用比值作為輸出信號能夠在一定程度上消除來自體系本身和背景的電化學信號的潛在干擾，提供內(nèi)部自校準，提高檢測靈敏度和選擇性。本文主要綜述了比例電化學生物傳感器的構(gòu)造策略及其在蛋白質(zhì)、核酸、生物小分子和金屬離子檢測等生化分析中的研究應(yīng)用進展，對該領(lǐng)域未來的發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景進行了展望。

關(guān)鍵詞 比例電化學生物傳感器； 超靈敏檢測； 生化分析； 評述

1 引 言

電化學傳感器是以離子導電為基礎(chǔ)的一種分析檢測裝置。作為一種非機械式傳感裝置，電化學傳感器主要利用與目標分子間的特異性識別作用準確感應(yīng)生物或化學目標，通過使目標分子在傳感器內(nèi)部發(fā)生電化學反應(yīng)，導致被測分子消耗或產(chǎn)生一定量的電活性物質(zhì)，在基礎(chǔ)電極的轉(zhuǎn)化傳導下，將目標物的反應(yīng)信息通過電信號的方式有序地輸出，從而實現(xiàn)分析檢測功能。電化學傳感器具有選擇性好、操作簡單、成本低廉、便于攜帶及不破壞測試體系、不受顏色影響等優(yōu)點[1，2]，在臨床醫(yī)學診斷、藥物和食品分析及環(huán)境檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。電化學傳感器通常由敏感識別元件、信號轉(zhuǎn)換元件和檢測元件三部分組成。常用的識別元件為生物材料，信號轉(zhuǎn)換元件為電極，電勢、電流或電導等作為檢測信號?；谔囟ǖ纳锓肿幼R別機制，固定在電極表面上的生物分子（例如抗原、抗體、激素和酶等）可將目標分子捕獲至電極表面[3～6]。在外加電壓的作用下，該識別過程伴隨著電子轉(zhuǎn)移進行，并導致電化學信號（例如電壓、電流和阻抗等）的變化[7～9]。根據(jù)電化學生物傳感器在構(gòu)建過程中有無標記，可將其分為標記型電化學生物傳感器和無標記型電化學生物傳感器。無標記型電化學生物傳感器具有無需標記、操作方便和假信號率低等優(yōu)勢，但其檢測靈敏度較低，不利于生物分子的靈敏檢測。標記型電化學生物傳感器的標記過程相對復雜繁瑣，但其靈敏度相對較高。然而，傳統(tǒng)的單標記傳感器存在著制約其發(fā)展的固有缺陷。首先，單一標記存在靈敏度低的問題，對于超痕量檢測無能為力； 其次，由于單標記是“一對一”的電信號輸出模式，假陽性和假陰性識別都可能會引發(fā)信號改變，從而無法對信號進行甄別。

與傳統(tǒng)的單一電信號輸出的電化學生物傳感器相比，比例電化學傳感器可利用兩種電活性物質(zhì)在不同電位產(chǎn)生電信號，實現(xiàn)在同一傳感體系中的雙信號響應(yīng)，采用雙重信號的比例強度進行分析可有效避免固有背景產(chǎn)生的電化學信號的潛在干擾。因此，比例電化學傳感器對來自系統(tǒng)本身或背景的電信號影響具有內(nèi)置校正能力，顯示出較高的靈敏度和選擇性。具有高選擇性和高靈敏度的比例電化學傳感器是一種理想的分析工具，可在復雜的檢測系統(tǒng)中實現(xiàn)目標物的高選擇性和穩(wěn)定性分析[10～14]。比例電化學傳感器通常需要選擇兩種或兩種以上的電活性分子產(chǎn)生電信號，通過分析不同電位下兩種電活性分子產(chǎn)生電信號的比值，實現(xiàn)其分析檢測功能。通常使用的電活性分子有亞甲基藍（MB）、二茂鐵（Fc）和硫堇（Thi）等。近年來，大量研究工作致力于發(fā)展雙信號傳感模式（即比例電化學傳感）， 包含雙信號或多信號模式的多種比例電化學傳感器的相繼成功構(gòu)建，使比例電化學傳感器在化學和生物傳感領(lǐng)域得到越來越多的關(guān)注，并展現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景[15～20]。本文系統(tǒng)總結(jié)了比例電化學傳感器的制備策略及其在蛋白質(zhì)[21～29]、核酸[30～41]、生物小分子[42～56]、金屬離子[57～67]等分析研究中的應(yīng)用，并對比例電化學傳感器的發(fā)展前景進行了展望。

2 比例電化學傳感器的制備策略

比例電化學生物傳感器根據(jù)電化學信號峰值強度的比值檢測分析物，在一定程度上提高了檢測靈敏度和選擇性。根據(jù)電化學信號和被分析物的關(guān)系，可將比例電化學生物傳感器的制備策略分為兩類：內(nèi)置參比信號的比例電化學傳感策略和雙重參比信號的比例電化學傳感策略。對于傳統(tǒng)的單信號傳感策略（圖1A），其電信號隨分析物濃度的變化呈單一變化。而對于雙信號傳感策略（即比例電化學傳感策略）（圖1B），既可設(shè)計僅有一個電化學信號依賴于分析物含量、另一個電化學信號與分析物的含量無關(guān)的內(nèi)置參比信號比例電化學傳感器，又可構(gòu)建兩個電化學信號均取決于分析物含量的雙重參比信號比例電化學傳感器。

2.1 內(nèi)置參比信號的比例電化學傳感

利用內(nèi)置參比信號傳感策略構(gòu)建的比例電化學傳感器具有靈敏度高、檢出限低、不易受外界環(huán)境因素干擾等特點，目前已被廣泛用于生物傳感領(lǐng)域。通過引入氧化還原活性物質(zhì)（如MB、Fc和Thi）作為內(nèi)置參比，可消除來自儀器設(shè)備、檢測環(huán)境、樣品本身的干擾因素。在應(yīng)用內(nèi)置參比信號傳感策略制備比例電化學生物傳感器的過程中，可使用不同的電化學檢測方法或信號轉(zhuǎn)導模式，但要保證內(nèi)置參比信號的強度在分析物濃度發(fā)生變化的情況下保持恒定。采用響應(yīng)信號與內(nèi)部參比信號峰值強度比作為分析物的測量標準，可有效減少在電化學傳感過程中由微環(huán)境和其它因素引起的誤差，提高比例電化學生物傳感器的靈敏度、重復性和準確性[15]。Luo等[58]設(shè)計了一種內(nèi)置參比信號比例生物傳感器，用于檢測活大鼠腦中Cu2+和γ-半胱氨酸（CySH）的含量（圖2）。該檢測系統(tǒng)主要由金納米葉修飾的碳纖維微電極（CFME）以及能與Cu2+特異結(jié)合的N，N-2-吡啶基乙二胺（DPEA）組成。金納米葉的修飾可顯著提高系統(tǒng)的比表面積和電催化性能。MB修飾的核苷酸序列作為內(nèi)參照物，可抑制來自腦組織中其它生物分子與離子的干擾。首先與DPEA結(jié)合的Cu2+在特定電壓下顯示一個峰值電流密度，該峰值隨Cu2+濃度增加而增大。CySH的加入將導致Cu2+與其發(fā)生絡(luò)合并與DPEA分離，引起峰值降低。在此過程中，作為內(nèi)置參比的MB的修飾核酸序列始終在另一電壓下具有恒定的峰值電流密度。在人工腦脊液（aCSF）中，根據(jù)不同濃度下的Cu2+與內(nèi)參比分子的峰值電流密度比值，可得到Cu2+的線性檢測范圍為1～14 μmol/L，檢出限可達320 nmol/L，此外，根據(jù)不同濃度下的CySH與內(nèi)參比分子的峰值電流密度比，得到CySH的線性檢測范圍為1～12 μmol/L，檢出限為 480 nmol/L。Cai等[21]利用電極表面修飾的聚硫堇-金（PTh-Au）產(chǎn)生的電信號作為內(nèi)置參比信號，電解液中K3[Fe（CN）6]產(chǎn)生的電信號作為檢測信號，制備了一種比例電化學免疫傳感器。該傳感器可實現(xiàn)對腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）的靈敏檢測，檢測范圍為0.005～40 ng/mL，檢出限為2.2 pg/mL。當CEA通過免疫反應(yīng)固定在修飾電極上時，將阻礙K3[Fe（CN）6]在電極上的電子傳遞，使檢測信號發(fā)生改變，而PTh-Au產(chǎn)生的參比信號在合適的電解液pH值下始終保持恒定。通過分析檢測信號與恒定的內(nèi)參比信號之間的比值可準確檢測CEA濃度。

2.2 雙重參比信號的比例電化學傳感

雙重參比信號的比例電化學生物傳感構(gòu)造策略主要基于目標分子被識別前后兩種電活性標記物與電極表面的距離改變導致電化學信號的變化。這種傳感策略不僅能夠提高檢測的靈敏度，還可避免一些與分析物無關(guān)（如電極面積變化、目標分子非特異性吸附等）的干擾。利用電極表面兩種電活性分子電信號變化的比值作為輸出信號，可減小復雜樣品帶來的信號波動，提高重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。目前，該傳感策略已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)[22～29]、核酸[30～41]、金屬離子[57～67]以及其它生物小分子[43～56]的分析檢測。

3 比例電化學生物傳感器的分析應(yīng)用

3.1 檢測蛋白質(zhì)

目前，比例電化學傳感器已成功用于腫瘤標志物CEA[21]、前列腺特異抗原（PSA）[23]、凝血酶[22，27]、朊病毒蛋白[25]以及其它蛋白酶[23，24，26～28]的檢測，顯示出高選擇性、高靈敏度、低檢出限及良好的穩(wěn)定性。Gao等[22]設(shè)計了一種雙信號比例電化學適配體傳感器，通過靶標催化循環(huán)雜交自組裝對凝血酶進行檢測（圖3）。該傳感器含有兩個DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)：H1和H2。其中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)H1的3′端修飾有Fc且具有一段凝血酶適配序列，在無凝血酶存在下該適配序列與結(jié)構(gòu)中另一段互補序列配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)H2的3′端標記有MB且具有一段和H1序列互補的序列。他們首先將發(fā)夾結(jié)構(gòu)H2修飾在電極上，使MB靠近電極表面，產(chǎn)生較強的電化學信號。由于H1含凝血酶適配序列，靶蛋白凝血酶的加入能打開H1發(fā)夾結(jié)構(gòu)，暴露出H1中與H2序列互補的部分，促進H1與電極表面H2的雜交。H2可通過DNA分支遷移將靶蛋白從H1上置換釋放，使Fc分子靠近電極表面而MB分子遠離電極表面，最終導致MB和Fc電化學信號的改變。釋放的靶標蛋白可繼續(xù)打開另一個H1，觸發(fā)上述循環(huán)過程。該雙信號比例適配傳感器利用IFc/IMB作為響應(yīng)信號，展現(xiàn)較高的靈敏度和重復性，檢測范圍為0.1 pmol/L～10 nmol/L， 檢出限為41 fmol/L。該傳感器對靶蛋白凝血酶具有高選擇性。當體系同時存在多種類似生物分子（如免疫球蛋白G（IgG）、三磷酸腺苷（ATP）和人血清白蛋白（HSA））時，凝血酶的測定不受干擾。Ren等[23]發(fā)展了可一步測定蛋白質(zhì)生物標志物的比例電化學傳感策略。該方法將Fc標記的發(fā)夾DNA固定在金電極表面以獲得傳感界面。在MB標記的DNA-抗體1（DNA1-Ab1）和DNA2-抗體2（DNA2-Ab2）兩種探針存在的情況下，靶蛋白的加入可誘導兩種探針之間的夾心免疫反應(yīng)，引發(fā)DNA1和DNA2的雜交，打開電極表面的發(fā)夾DNA，在傳感界面上形成三臂DNA結(jié)構(gòu)。這種DNA組裝導致Fc離開電極、MB接近電極，引起Fc和MB電信號變化，產(chǎn)生可測量的比例電化學信號。該傳感器檢測PSA的檢出限為4.3 pg/mL，線性檢測范圍為0.01～200 ng/mL。通過改變親和性探針鏈接的抗體，該方法可進一步用于其它抗原檢測。

Yu等[25]基于靶蛋白調(diào)控的主客體競爭策略，構(gòu)建了可檢測朊病毒蛋白（Prion）的比例電化學生物傳感器（圖4）。他們利用β-環(huán)糊精（β-CD）和MB間的主客體相互作用，將帶有MB標記的朊病毒蛋白適配體（MB-Apt）引入到多壁碳納米管-β-環(huán)糊精（MWCNTs-β-CD）復合物修飾的玻碳電極上。在無朊病毒蛋白存在時，位于β-CD內(nèi)腔的MB-Apt被羧酸二茂鐵（FCA）置換，從而將FCA引入電極表面，產(chǎn)生較大的FCA氧化峰電流。在朊病毒蛋白存在時，朊病毒蛋白與其適配體MB-Apt相互作用形成封閉β-CD內(nèi)腔的生物門（Biogate），阻礙FCA通過客體置換作用進入β-CD內(nèi)腔，導致MB的氧化峰電流增大、FCA的峰電流減小，引起相應(yīng)的比例電化學信號變化。該傳感器對靶蛋白具有較好的選擇性，檢出限可達160 fmol/L。

3.2 檢測核酸

核酸檢測在重大疾病的早期診斷、預(yù)后判斷及環(huán)境監(jiān)測等方面發(fā)揮著十分重要的作用。比例電化學生物傳感器可實現(xiàn)對核酸的簡單、快速、超靈敏檢測[30～41]。Cui等[30]發(fā)展了一種基于DNA四通結(jié)構(gòu)（DNA-4WJ）及酶輔助循環(huán)放大的比例電化學生物傳感器（圖5）。該傳感器主要由一個組裝到金電極表面的三鏈分子信標（THMB）和兩條未經(jīng)修飾的輔助DNA序列（α序列和β序列）組成。THMB由MB標記的發(fā)夾探針（HP）和Fc標記的核苷酸序列（UT）組成，并經(jīng)UT固定于電極表面。HP的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使MB靠近電極表面并產(chǎn)生強的電化學信號，而UT構(gòu)型的展開則導致Fc遠離電極表面產(chǎn)生弱的電化學信號。由于在兩條輔助DNA（α序列和β序列）中各含有一段HP的互補序列和一段目標DNA的互補序列，目標DNA和兩條輔助DNA可與HP雜交形成DNA-4WJ結(jié)構(gòu)，破壞THMB結(jié)構(gòu)，并導致MB遠離電極表面和MB電化學信號降低、Fc靠近電極表面和Fc電化學信號增大，從而引起MB與Fc的比例電化學信號變化。通過RNase HII對DNA-4WJ結(jié)構(gòu)進行酶切，可釋放HP和輔助DNA序列，引發(fā)下一輪循環(huán)，實現(xiàn)酶輔助的信號循環(huán)放大。該比例電化學傳感器制備簡單，靈敏度高，檢測范圍為0.1 pmol/L～100 nmol/L，檢出限可達0.063 pmol/L。另外，DNA-4WJ結(jié)構(gòu)的引入可保證該傳感器對目標DNA具有較高的選擇性。

miRNA與腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是臨床診斷的重要生物標志物。Zhang等[32]開發(fā)了一種基于兩足DNA“步行者”（DNA walkers）的比例電化學生物傳感器，用于檢測癌細胞外泌體中的miRNA-21。該DNA“步行者”由兩部分“足”序列和一部分“體”序列組成，并通過“體”序列與連接于磁珠上的互補DNA鏈雜交。其行走軌道是修飾于電極表面的MB標記的發(fā)夾DNA（MB-H1）。miRNA-21的存在可釋放磁珠上的DNA“步行者”，該“步行者”沿著DNA軌道持續(xù)行走，將MB-H1發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開并暴露其粘性末端。當加入Fc標記的發(fā)卡DNA（Fc-H2）時，通過粘性末端介導的鏈置換反應(yīng)（TMSDR）與MB-H1雜交形成雙鏈，釋放DNA“步行者”并啟動下一循環(huán)。多次循環(huán)導致電極表面Fc含量增加，電流信號增大，而作為內(nèi)置參比信號分子的MB與電極距離不變，電流信號不變。該方法通過測量電流信號比率可實現(xiàn)對miRNA的靈敏檢測，檢測范圍為0.1 fmol/L～100.0 fmol/L，檢出限可達67 amol/L，可用于乳腺癌細胞系和血清中miRNA-21的檢測。Yuan等[33]提出了基于雙鏈特異性核酸酶（DSN）雙信號放大的比例電化學傳感器用于檢測miRNA。他們將Fc標記的發(fā)夾捕獲探針（CP）固定在Au電極上以獲得傳感界面。目標miRNA與CP雜交并打開CP的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成miRNA-DNA雙鏈。DSN可特異性剪切miRNA-DNA雙鏈中的DNA鏈，釋放目標miRNA，并引發(fā)下一輪剪切過程，導致大量Fc隨DNA鏈的剪切而離開電極表面，F(xiàn)c電信號減小。電極上剩余的DNA片段可作為雜交鏈反應(yīng)（HCR）的引物，在另外兩條DNA單鏈（HDNA和HDNA′）存在下捕獲含有Thi的AuNPs連接的DNA（DNA/Au NPs/Thi），形成雙鏈DNA聚合體，導致大量Thi聚集于電極表面，Thi電信號增大。該方法通過分析Fc和Thi電流比例值（IThi/IFc）的變化，可選擇性檢測miRNA-141，檢測范圍為0.1 fmol/L～100.0 pmol/L，檢出限可達11 amol/L。

3.3 檢測生物小分子

生物小分子（如抗壞血酸（AA）、雙酚A（BPA）、腺苷、H2O2、H2S等）在人體新陳代謝和生命活動中起著非常重要作用，與人類健康密切相關(guān)[42～56]?？箟难崾侨梭w必不可少的營養(yǎng)素，同時也是體內(nèi)的抗氧化劑，可保護人體免受自由基的威脅，在多種生理和病理過程中起關(guān)鍵作用[42，54]。Wang等[42]將金屬有機骨架材料（PCN-333（Al），PCN代表多孔配位網(wǎng)絡(luò)）用于比例電化學生物傳感器的構(gòu)建，并將其應(yīng)用于抗壞血酸（AA）的檢測（圖6）。他們將AA的催化劑科琴黑（Ketjenblack，KB）和作為內(nèi)參比信號分子的Thi包封到PCN-333（Al）的孔洞中，并將PCN-333（Al）修飾于玻碳電極上。PCN-333（Al）中的KB可催化氧化AA，產(chǎn)生氧化峰電流，而Thi所產(chǎn)生的內(nèi)置參比信號不變，因而利用兩者間電流比率可實現(xiàn)對AA的靈敏檢測。該生物傳感器檢測范圍為14.1～5.5 mmol/L（R2=0.998），檢出限為4.6 mmol/L。 PCN-333（Al）的多孔結(jié)構(gòu)可有效固定KB和Thi，避免了KB和Thi在電極表面的粘附或聚集，提高了傳感器的穩(wěn)定性。同時，PCN-333（Al）可選擇性地將目標分析物積累到孔中，提高檢測選擇性。

Cui等[45]發(fā)展了一種基于MB與交替的AT堿基序列間的相互作用的比例電化學傳感器，并將其應(yīng)用于生物小分子腺苷的檢測（圖7）。他們將一條DNA鏈1作為捕獲探針并固定于金電極表面，在該鏈的近3′端胸腺嘧啶（T）堿基處修飾MB。同時設(shè)計另一條3′端標記有Fc的適配體鏈用于識別腺苷。在無腺苷存在時，這兩條DNA鏈部分互補配對，導致MB遠離電極表面、Fc接近電極表面，產(chǎn)生較小的峰值電流比（IMB/IFc）。值得注意的是，造成較小IMB/IFc值的原因包括：（1）MB與電極表面間距離增大； （2）MB與聚（T-A）雙鏈結(jié)構(gòu)相互作用導致其電子轉(zhuǎn)移速率下降。當腺苷存在時，其與Fc標記的適配體鏈形成G-四連體結(jié)構(gòu)，導致適配體鏈離開電極表面、Fc遠離電極表面、MB接近電極表面，產(chǎn)生較大的IMB/IFc值。該方法通過對IMB/IFc值的分析可靈敏的檢測腺苷，檢出限可達90.8 pmol/L，檢測范圍為0.1 nmol/L～100 μmol/L。

過氧化氫（H2O2）是一種多功能的生物標志物，廣泛參與到酶催化、細胞信號傳導等過程。H2O2是活潑的羥基自由基（·OH）的前體，而·OH與其他活性氧（ROS）物種被認為與引發(fā)各種疾病的氧化應(yīng)激過程有關(guān)[50]。Goggins等[50]設(shè)計合成了硼酸酯-二茂鐵衍生物作為H2O2探針，該探針在電壓為0.05 V時顯示一個氧化峰電流。H2O2能氧化該探針并促使硼酸酯水解脫落，得到氨基二茂鐵，導致0.05 V電壓處硼酸酯-二茂鐵衍生物的氧化電流峰降低，0.2V電壓處氨基二茂鐵的氧化峰電流出現(xiàn)并逐漸增大。通過檢測氨基二茂鐵與硼酸酯-二茂鐵衍生物的峰電流并計算其轉(zhuǎn)化率，可實現(xiàn)對H2O2的比例電化學檢測，線性檢測范圍為0～800 μmol/L。

硫化氫（H2S）是生物系統(tǒng)中的氣體遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)心血管、神經(jīng)元和免疫系統(tǒng)的作用。H2S水平異常與多種疾病（例如慢性腎臟疾病、肝硬化和唐氏綜合征）相關(guān)。Manibalan等[51]設(shè)計合成了兩種含有疊氮引發(fā)基團和報告基團的H2S探針（疊氮基芐基二茂鐵氨基甲酸酯（ABFC）和N-烷基疊氮基芐基二茂鐵氨基甲酸酯（NABFC）），實現(xiàn)了對活細胞釋放的H2S的實時定量檢測。在無H2S時，兩種探針均在0.23V電壓下具有峰電流。H2S可特異性地觸發(fā)兩種探針釋放報告基團：氨基二茂鐵（FA）和N-烷基氨基二茂鐵（NFA），這兩種報告基團分別在0.06 V和0.1 V電壓下產(chǎn)生新的峰電流。該方法通過分析峰電流比率信號，可特異的檢測H2S，兩種探針的檢出限分別為0.32 μmol/L（10.6 ppb，ABFC）和0.076 μmol/L（2.54 ppb，NABFC）。

3.4 檢測金屬離子

金屬離子（如Cu2+、Cd2+和Hg2+等）的精確測定在生物學、醫(yī)學、環(huán)境和化學等領(lǐng)域非常重要[57～67]。環(huán)境中潛在的Hg2+能對生理系統(tǒng)造成嚴重損害，并引起多種急性和慢性疾病[15]。Jia等[57]開發(fā)了一種基于Y型-DNA結(jié)構(gòu)的比例電化學傳感器，并將其應(yīng)用于檢測Hg2+（圖8）。他們利用標記有MB和Fc的DNA探針形成Y-型DNA結(jié)構(gòu)并將其固定在金電極表面。由于Fc靠近電極，MB遠離電極，可得到明顯的Fc強信號和MB弱信號。Hg2+可與Y-型DNA結(jié)構(gòu)中的T-T錯配堿基對形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T復合物，將Y型-DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在轉(zhuǎn)化過程中，MB靠近電極表面、MB峰電流增大，F(xiàn)c遠離電極表面、Fc峰電流減小。他們用方波伏安法（SWV）檢測Hg2+，檢測范圍為1 nmol/L～5 mmol/L，檢出限為0.094 nmol/L。Hg2+與T-T錯配堿基對之間的特異性結(jié)合保證了該生物傳感器的良好選擇性。利用L-半胱氨酸與Hg2+配位作用，可恢復電極表面的Y型-DNA結(jié)構(gòu)，使傳感器再生。

Cu2+參與調(diào)節(jié)骨形成、細胞呼吸和結(jié)締組織發(fā)育等生理過程[59～63]，高濃度的Cu2+對生物組織具有毒副作用。Yu等[59]利用雙羥基官能團化的聚離子液體（DHF-PIL）為催化劑基底構(gòu)建了比例電化學生物傳感器，并將其應(yīng)用于檢測鼠腦中的Cu2+。DHF-PIL的大孔結(jié)構(gòu)為生物分子的充分負載提供了高表面積。他們通過靜電相互作用將內(nèi)置參比信號分子2，2′-氮雜雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽）（ABTS）及Cu2+特異性識別分子神經(jīng)激肽B（NKB）修飾到DHF-PIL。NKB可特異性的結(jié)合Cu2+形成[CuII（NKB）2]復合物，并產(chǎn)生Cu2+的氧化峰電流，而內(nèi)參比ABTS在整個過程中峰電流強度不變。該傳感器應(yīng)用微分脈沖伏安法（DPV）分析Cu2+與ABTS峰電流的比率，對Cu2+的檢出限為0.24 μmol/L，線性檢測范圍為0.9～36.1 μmol/L。該傳感器具有較高的選擇性，能抵御大腦中可能存在的一系列干擾物質(zhì)（如金屬離子（Ca2+、Fe3+、Mg2+、Na+等）、氨基酸（Cys、Phe、Met、Gly等）、內(nèi)源性化合物（抗壞血酸、多巴胺、尿酸、葡萄糖、乳酸等））對檢測結(jié)果的干擾。

4 總結(jié)與展望

比例電化學生物傳感器對來自系統(tǒng)或背景電信號的影響有內(nèi)置校正能力，能夠克服傳統(tǒng)的單信號電化學傳感器的局限性（例如靈敏度較低、“假陽性”或“假陰性”信號等），具有較高的檢測準確度和靈敏度。本文系統(tǒng)綜述了比例電化學生物傳感器的兩種制備策略：內(nèi)置參比信號的比例電化學傳感策略和雙重參比信號的比例電化學傳感策略及其在生化分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。目前，比例電化學生物傳感器已成功應(yīng)用于分析檢測蛋白（凝血酶）[22，27]、核糖核酸（DNA[30，31，34，35，38，39]、miRNA[32，33，36，37]），抗原（CEA[21]、朊病毒[25]等）、生物小分子（抗壞血酸[41，54]、CySH[58]、雙酚A[43，44]、腺苷[45]、DOX[46]、葡萄糖[50，53，55]、H2O2[50]、H2S[51]等）和金屬離子（Hg2+[57]、 Cu2+[59～63]、 Cd2+[64]）等。隨著對比例電化學生物傳感器研究的深入，未來有望開發(fā)出一系列可用于腫瘤標志物（例如α-胎兒蛋白質(zhì)、CA125抗原、鱗狀細胞癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原、神經(jīng)元特異性烯醇酶或人絨毛膜促性腺激素）、生物小分子和生物毒性離子（例如Pb2+和Ag+等）檢測的比例電化學生物傳感器。值得注意的是，比例電化學生物傳感器仍然存在著以下問題：（1）可標記信號分子種類有限； （2）標記成本較高。因此，開發(fā)成本低廉、簡單易得、功能多樣的比例電化學生物傳感器將成為未來該領(lǐng)域發(fā)展的重點。目前比例電化學傳感器的發(fā)展主要呈現(xiàn)出以下趨勢：

（1）發(fā)展新型無標記的比例電化學傳感模式。通過納米材料包覆電化學活性分子或者利用生物分子原位生長納米材料的方法，發(fā)展無標記、低成本、高靈敏度的比例電化學傳感器。

（2）構(gòu)建便攜式比例電化學生物傳感儀器。結(jié)合絲網(wǎng)印刷等技術(shù)，有望實現(xiàn)比例電化學傳感器的小型便攜化，推動比例電化學生物傳感器的商業(yè)化。

（3）開發(fā)多功能比例電化學生物傳感器。在一個傳感系統(tǒng)中應(yīng)用雙重或多重比例電化學信號傳感模式進行雙重/多重生化分析。

（4）比例電化學技術(shù)與其它技術(shù)（例如拉曼光譜、氣相色譜和質(zhì)譜等）相結(jié)合，將比例電化學的應(yīng)用范圍拓展至活體分析和在線分析。

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