王新杰 姬小利 王敏 周君梅

生殖健康是人類社會得以繼續(xù)繁榮發(fā)展和進步的關(guān)鍵和保證。男性不育是亟待解決的一大問題，其原因和機制有待研究，但因倫理限制，不能利用人類胚胎開展研究，因此在體外建立合適的研究模型成為解決問題的一種新思路。

胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）是一種來源于早期胚胎囊胚階段內(nèi)細胞團的具有自我更新能力及多向分化潛能的細胞，可在體外定向誘導分化為三個胚層的各種類型成體細胞。已有研究表明，小鼠的ESCs可在體外誘導分化為成熟的單倍體精子，且這些精子可使卵子受精并得到存活的后代[1]。人的ESCs也可在體外誘導分化為生殖細胞[2]，但是，人ESCs的建立需破壞早期胚胎，將其用于生物醫(yī)學研究存在倫理及技術(shù)限制等諸多制約[3]。2006年，誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出現(xiàn)為解決以上難題提供了可能。iPSCs是多能干細胞的一種，通過在體外向成體細胞中導入與ESCs多能性密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，誘導其重編程，可得到iPSCs。2006年，日本科學家首次將四種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4 和c-Myc通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導入小鼠皮膚成纖維細胞，使之重編程后得到了具有ESCs特性的小鼠iPSCs[4]。2007年，該研究小組又通過同樣的方法成功獲得了人iPSCs[5]。同年，美國科學家用另外一組轉(zhuǎn)錄因子，即Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28成功地將人的皮膚成纖維細胞重編程，得到人iPSCs[6]。iPSCs的形態(tài)特征、增殖能力和分化潛能等均與ESCs相似，但具有ESCs不具備的以下優(yōu)勢：（1）其種子細胞來源廣泛，包括皮膚成纖維細胞、神經(jīng)干細胞、尿源性細胞、脂肪細胞、羊水細胞、肝細胞和角質(zhì)細胞等[7]；（2）避開了破壞人類胚胎的倫理問題；（3）自體細胞的移植應(yīng)用避免了免疫排斥問題。同時，由于ESCs與iPSCs均具備分化成多種成體細胞的能力，因此，可利用ESCs / iPSCs向生殖細胞分化為體外模型，研究人類生殖細胞的發(fā)育規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，建立帶有人類疾病遺傳背景的iPSCs模型，體外向雄性生殖細胞方向誘導分化，利用該模型來研究男性不育的發(fā)病機制。精子的形成是一個雄性生殖細胞分化、增殖和成熟的復雜過程，該過程可分為2個階段：第1階段是原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）形成，繼之向精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）方向分化；第2階段是SSCs向精子細胞方向分化，經(jīng)過有絲分裂和兩次減數(shù)分裂，最終形成成熟的精子[8]。該過程的不同階段受到不同誘導因子的作用，因此，為了更好地在體外模擬精子的形成過程，誘導因子的選擇及添加時間應(yīng)根據(jù)以上生殖細胞在體內(nèi)的發(fā)育規(guī)律而定、在不同發(fā)育階段循序加入，從而達到更好地研究發(fā)病機制的目的，為維護和促進生殖健康奠定重要基礎(chǔ)。

本文將對多能干細胞向雄性生殖細胞定向誘導分化的常用誘導因子及存在問題和展望進行綜述，為相關(guān)研究的開展提供借鑒。

一、ESCs / iPSCs向雄性生殖細胞誘導分化常用的誘導因子

由于精子在體內(nèi)形成遵循一定的規(guī)律，體外環(huán)境中，不同發(fā)育階段的生殖細胞在不同誘導因子作用下可穩(wěn)定地往下一階段定向分化，為模擬精子在體內(nèi)的形成過程，誘導ESCs / iPSCs向雄性生殖細胞方向分化的誘導因子種類及加入時間的選擇應(yīng)根據(jù)生殖細胞的體內(nèi)發(fā)育特征而定，在誘導的不同階段循序加入，一般可分為前期常用誘導因子、中期常用誘導因子和后期常用誘導因子。

（一）前期常用誘導因子

1. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic protein，BMP）家族：BMP最初可用來誘導骨形成。近年來，隨著研究的深入，科學家們發(fā)現(xiàn)BMP家族在胚胎發(fā)育和組織細胞分化中也起到重要作用，其中BMP4更是一種關(guān)鍵因子。BMP4屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β家族的重要成員之一，在體內(nèi)可影響睪丸的發(fā)育和生殖細胞的功能，是生殖細胞發(fā)育過程中的重要信號。在胚胎發(fā)育時期，BMP4作為分泌配體與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，激活Smad信號通路，從而調(diào)控ESCs / iPSCs向PGCs的方向分化[9]。因此，在誘導ESCs / iPSCs向生殖細胞分化的起始階段，BMP4是最為常用的關(guān)鍵因子[10]。

2009年，Ohinata等[11]將2只小鼠ESCs的BMP4和BMP8b基因分別敲除，導致二者外胚層細胞的PGCs特異性基因BLIMP1缺失，最終導致PGCs的缺失。同年，Kee等[12]將BMPs導入人的ESCs中，誘導分化14 d后，有5%的細胞表達生殖細胞特異性蛋白VASA，并且由實驗觀察到早期生殖細胞標志性基因DAZL，BLIMP1，STELLAR和VASA表達增加，其中，BLIMP1和STELLAR是PGCs的特異性基因，DAZL基因可促進PGCs的形成。2011年，Panula等[13]通過向培養(yǎng)基中添加BMP4、BMP7和BMP8b誘導因子，誘導人iPSCs向生精細胞方向分化，連續(xù)誘導7 d后，檢測到4.85%的細胞表達生殖細胞特異性標志物VASA，并 且 有 5% 的 PGCs形 成。2015年，Sasaki等[14]使 用BMP4、SCF、EGF、LIF聯(lián)合誘導人iPSCs向生精細胞分化，6 d后，有32%的細胞共表達生殖細胞早期特異性標志物EpCAM和INTEGRINα6，同時得到了人原始生殖細胞樣細胞（primordial germ cells-like cells，PGCLCs）。以上研究表明，BMPs在誘導ESCs / iPSCs向雄性生殖細胞方向分化的前期階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要用于誘導得到PGCs。

2.白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、干細胞因子（stem cell factor，SCF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）：LIF是一種多效性細胞因子。PGCs膜表面存在LIF特異性受體LIF-R復合物，LIF通過與LIF-R特異性結(jié)合促進PGCs增殖。SCF是原癌基因c-kit編碼的酪氨酸激酶受體c-kit的配體，SCF與c-kit相互作用有助于PGCs與體細胞的黏附及促進PGCs增殖。EGF是最早發(fā)現(xiàn)的生長因子，通過與細胞表面的表皮生長因子受體結(jié)合發(fā)揮促進細胞增殖的作用。這三種生長因子在誘導前期主要用于維持PGCs存活以及促進PGCs增殖。

2011年，Hayashi等[15]首先利用堿性成纖維生長因子和激活素A誘導小鼠ESCs，48 h后得到外胚層樣細胞，之后使用 BMP4、LIF、SCF、EGF 誘導外胚層樣細胞，4 ～ 6 d后得到PGCLCs。2016年，Wang等[16]用相同的方法誘導豬iPSCs向生殖細胞方向分化，僅4 d得到PGCLCs。2013年，Gafni等[17]在誘導人ESCs向生殖細胞方向分化過程中，首先將人ESCs誘導至原始狀態(tài)，之后利用BMP4、LIF、SCF、EGF聯(lián)合誘導，4 ～ 5 d后得到人PGCLCs。2015年，Sasaki等[14]誘導人iPSCs向雄性生殖細胞分化，在培養(yǎng)基中加入 BMP4、LIF、SCF、EGF，6 d后，檢測到生殖細胞早期特異性標志物EpCAM和INTEGRINα6表達增加，并且得到人PGCLCs。以上研究表明，LIF、SCF、EGF在誘導ESCs / iPSCs向雄性生殖細胞方向分化的前期發(fā)揮重要作用，主要用于維持PGCs存活以及促進PGCs增殖，對穩(wěn)定BMPs的誘導效果有重要作用。

綜合上述實驗結(jié)果可見，BMPs、LIF、SCF、EGF廣泛用于誘導ESCs / iPSCs向雄性生殖細胞方向分化的前期階段。BMPs主要用于誘導ESCs/iPSCs向PGCs方向分化，在誘導前期起著關(guān)鍵作用，LIF、SCF、EGF主要發(fā)揮維持PGCs存活、促進PGCs增殖以及穩(wěn)固BMPs誘導效果的作用。因此，當以上4種因子聯(lián)合作用時，可有效誘導得到PGCs。

（二）中期常用誘導因子

1.睪酮：精子發(fā)生是一個依賴激素的過程。男性生殖細胞的發(fā)育受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)與控制，睪酮是其中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要分子之一。睪酮是一種類固醇激素，在黃體生成素和促卵泡激素作用下由睪丸間質(zhì)細胞合成和分泌，作用于支持細胞，促使支持細胞合成和分泌雄激素結(jié)合蛋白。睪酮與雄激素結(jié)合蛋白有很強的親和力，結(jié)合后可促進生殖細胞的分化[18-19]。此外，有研究報道睪酮可通過刺激生精小管管周肌樣細胞及支持細胞分泌神經(jīng)膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF），從而促進SSCs的自我更新，進而保證精子發(fā)生的持續(xù)進行[20]。

2013年，Zanganeh等[21]將小鼠的SSCs與支持細胞共培養(yǎng)，加入睪酮、促卵泡激素及維生素后，誘導一周，得到精子細胞樣細胞（spermatid-like cells，SLCs）。2016年，Zhou等[22]將小鼠PGCLCs與新生小鼠睪丸體細胞共培養(yǎng)，加入睪酮、促卵泡激素及牛垂體提取物，誘導10 d后得到單倍體的SLCs，14 d后，SLCs陽性率達到14%～ 20%，將獲得的SLCs與野生型卵母細胞結(jié)合，得到具有生殖能力的健康后代。2017年，Deng等[23]在對照組中利用促卵泡激素、黃體生成素、GDNF等誘導羊SSCs，實驗組在此基礎(chǔ)上加入了睪酮，35 d后，對照組有5.54%的單倍體細胞產(chǎn)生，實驗組的單倍體細胞產(chǎn)生效率提高到了9.18%。將得到的單倍體SLCs與卵母細胞結(jié)合，結(jié)合后的細胞可進一步發(fā)育。以上研究表明，睪酮對促進小鼠和羊的生殖細胞向精子方向進一步分化有不可缺少的作用，但目前尚未有研究報道睪酮對人生殖細胞進一步分化的調(diào)控作用。

2. GDNF：生殖細胞是由PGCs分化形成[24]，在雄性動物中，PGCs首先分化為SSCs，再由SSCs進一步分化成精子細胞。因此，維持SSCs的自我更新和分化是雄性生殖細胞發(fā)育過程中的重要一環(huán)。

GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子-β家族的一員，由支持細胞產(chǎn)生，通過與SSCs表面的受體復合物GFRα1結(jié)合，激活RET酪氨酸激酶發(fā)揮生物學效應(yīng)。SSCs被認為是一種持續(xù)表達GFRα1的單個精原細胞[25]，近期有研究表明，在生精小管末端，GFRα1陽性表達的單個精原細胞是通過GDNF持續(xù)高表達得以選擇性維持的[26]。因此，GDNF對維持和擴增SSCs有重要作用。2000年，Meng等[27]發(fā)現(xiàn)GDNF是調(diào)節(jié)小鼠SSCs自我更新和分化的重要因子，通過在培養(yǎng)小鼠SSCs的培養(yǎng)基里加入GDNF，發(fā)現(xiàn)高濃度GDNF促使未分化的SSCs大量增殖，低濃度GDNF促使SSCs向生精細胞方向分化。2011年，Kubota等[28]實驗發(fā)現(xiàn)GDNF 同樣可促進非嚙齒類動物兔的SSCs自我更新和分化。2016年，Boozarpour等[29]首次指出，GDNF可誘導雞間充質(zhì)基質(zhì)細胞向精原干細胞樣細胞方向分化，并且推測GDNF有能力誘導雞間充質(zhì)干細胞分化成SSCs。同年，Chen等[30]通過實驗發(fā)現(xiàn)Gdnf基因被敲除的小鼠其GDNF表達量比野生型小鼠降低40%，并且在敲除后，其SSCs嚴重缺失。以上研究表明，GDNF是促進SSCs在體內(nèi)和體外自我更新和擴增的重要因子[31]。

綜上所述，睪酮對推動生殖細胞進一步分化及促進精子發(fā)生有重要作用，GDNF可促進SSCs自我更新及增殖，從而保證精子發(fā)生的持續(xù)進行。

（三）后期常用誘導因子

維甲酸（retinoic acid，RA）是維生素A的衍生物，在細胞分化、胚胎發(fā)育、器官形成和生殖等方面起到重要作用。RA通過激活精子形成相關(guān)基因Stra8促進生殖細胞進入減數(shù)分裂[32]。有實驗證明，小鼠睪丸支持細胞分泌的代謝酶Cyp26b1可降解RA，抑制RA信號，導致減數(shù)分裂被延遲。當性成熟時，Cyp26b1的表達量下降，RA信號重新啟動，減數(shù)分裂開始。因此，RA是生殖細胞進入減數(shù)分裂與否的開關(guān)[33-35]。

2010年，Dong等[36]利用RA誘導胎牛生殖細胞向后期方向分化，48 h后繼續(xù)用無RA的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 ～ 7 d，得到細長型SLCs，將這些細胞注入胎牛卵母細胞中，有23.1%的卵母細胞成功受精并開始卵裂。2014年，Wang等[37]利用RA誘導鼠SSCs向單倍體細胞方向分化，2 d后，轉(zhuǎn)為無RA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 ～ 8 d，結(jié)果顯示，減數(shù)分裂后特異性標志物Prm1表達增高，單倍體細胞相關(guān)基因Sycp3和TH2B表達增加。2016年，Wang等[38]利用RA誘導小鼠SSCs分化，僅24 h后，與SSCs分化及減數(shù)分裂相關(guān)的基因Stra8、c-Kit、SYCP3表達增高。2014年，Yang等[39]為幫助無精子癥患者得到有功能的配子，利用RA和SCF誘導來源于隱睪患者的人SSCs向單倍體精子方向分化，結(jié)果顯示，減數(shù)分裂特異性標志物SCP3、CREST、MLH1和單倍體細胞標志物Prm2、Acrosin的表達量均較對照組增高，并且得到了單倍體精子，將這些單倍體細胞與鼠卵母細胞結(jié)合，有60%成功受精并進一步發(fā)育。以上研究結(jié)果表明：在生殖細胞的發(fā)育過程中，RA對推動生殖細胞進入減數(shù)分裂并促進其向后期成熟方向分化起到非常關(guān)鍵的作用。此外，有研究表明在誘導ESCs / iPSCs向生殖細胞方向分化的過程中，生殖細胞的分化成熟程度對RA有濃度依賴性。2017年，Shah等[40]發(fā)現(xiàn)當加入的RA濃度為16 μmol/L時，與PGCs增殖及減數(shù)分裂相關(guān)的基因如DAZL、VASA、SYCP3等表達增高，當加入的RA濃度為2 μmol/L時，與生殖細胞成熟相關(guān)的基因如BOULE、TEKT1等表達增高，因此他們認為高濃度的RA（＞ 16 μmol/L）對于PGCs增殖及進入減數(shù)分裂有促進作用，而低濃度的RA（2 μmol/L）可促進后期生殖細胞的成熟。但是過高濃度的RA對細胞存在毒性，因此，在誘導分化過程中還需對RA的濃度以及培養(yǎng)基成分進行適當調(diào)整和把控。

二、存在的問題及展望

為研究男性不育的發(fā)病機制，一方面，可利用ESCs / iPSCs向生殖細胞分化為模型研究人類生殖細胞的發(fā)育規(guī)律，另一方面，在此基礎(chǔ)上，可建立帶有人類男性不育遺傳背景的iPSCs，體外誘導其向雄性生殖細胞方向分化，以此為模型研究不育的發(fā)病機制。目前，在這一研究過程中還存在一些問題。（1）在重編程得到iPSCs的過程中，由于加入了外源性轉(zhuǎn)錄因子，因此得到的iPSCs可能攜帶新的遺傳特征對后續(xù)進一步的誘導分化產(chǎn)生影響[41]。（2）目前，小鼠ESCs / iPSCs向生殖細胞分化的誘導體系已較為成熟，誘導得到的單倍體精子可與母鼠的卵細胞結(jié)合形成受精卵，并培育出具有生殖能力的健康后代。然而，人ESCs / iPSCs向生殖細胞誘導分化的研究進展則相對比較緩慢，誘導得到的多是較為早期的生殖細胞，分化較為成熟的生殖細胞仍然很難誘導獲得。究其原因，是由于物種之間的差異，人和鼠的生殖細胞體內(nèi)發(fā)育過程并非完全一致，一些在人PGCs階段表達的基因，如作用于內(nèi)胚層的SOX17、作用于滋養(yǎng)層的TEAD4等在鼠的PGCs階段并不表達[42-43]，因此，誘導鼠ESCs / iPSCs向生殖細胞方向分化的方案并不完全適用于人的ESCs / iPSCs。（3）誘導效率比較低。在小鼠方面，例如，2013年，Li等[44]利用RA或睪酮誘導小鼠iPSCs向雄性生殖細胞方向分化，結(jié)果顯示僅有2%～ 8%的單倍體細胞生成。2017年，Dong等[45]誘導小鼠ESCs向生殖細胞方向分化，利用SSCs培養(yǎng)基誘導時，得到的減數(shù)分裂后細胞只有1.36%，加入RA后，誘導效率有所提高，但也僅有17.2%，并且未得到更加成熟的生殖細胞。在人方面，例如，2011年，Eguizabal等[46]通過依次添加 FGF2、RA、hLIF、FRSK和R115866，誘導人iPSCs向生精細胞方向分化，9 ～ 10周后，檢測到僅有0.4%～ 2.3%的單倍體配子生成。2012年，Easley等[47]利用添加了GDNF、FGF的培養(yǎng)基誘導人iPSCs向生精細胞方向分化，誘導10 d后，檢測到僅有3.9%的單倍體配子生成。2014年，Lim等[48]利用BMP4和RA等三步法誘導人ESCs向生殖細胞分化，結(jié)果僅得到3%的單倍體生殖細胞。以上實驗結(jié)果看出，利用目前的研究方案誘導得到單倍體配子的效率并不高。因此，體外誘導ESCs / iPSCs向雄性生殖細胞方向分化的誘導方案還需進一步優(yōu)化。

如今，生殖健康受到越來越多的關(guān)注，男性不育成為影響生殖健康的一大問題。為研究其發(fā)病機制，同時避開倫理和技術(shù)等方面的限制，各研究小組利用攜帶男性不育遺傳背景的iPSCs模型。在模擬精子體內(nèi)發(fā)育過程的基礎(chǔ)上，于體外誘導其向雄性生殖細胞方向分化，在誘導分化過程中，從細胞形態(tài)特征，基因表達水平，生物標志物等多個方面，將疾病來源的iPSCs與正常人來源的iPSCs進行對比，發(fā)現(xiàn)兩者在發(fā)育過程中的差異，以此研究男性不育的發(fā)病機制。目前，新型基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，尤其是CRISPR / Cas9技術(shù)被廣泛應(yīng)用，在研究男性不育的發(fā)病機制時，可利用基因編輯技術(shù)對疾病來源的iPSCs進行基因修正，將此細胞株與攜帶疾病遺傳背景的iPSCs細胞株共同誘導分化，以此減少非致病因素的干擾，從而更精確地發(fā)現(xiàn)兩者發(fā)育過程中的差異，進而更好地研究男性不育的發(fā)病機制，而得到基因修正的iPSCs作為疾病治療的種子細胞用于臨床研究。除此之外，由于在體外誘導ESCs / iPSCs向雄性生殖細胞方向分化的過程模擬了精子在體內(nèi)的發(fā)育過程，因此，還可利用這一模型進行藥物胚胎毒性檢測及篩選。由此可見，ESCs / iPSCs的應(yīng)用前景廣闊，可誘導其向雄性生殖細胞方向分化，利用該模型研究男性不育發(fā)病機制、進行藥物檢測及用于疾病治療，為維護和促進生殖健康奠定重要基礎(chǔ)。