劉湄漪 陳乃耀

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一種多能干細胞，首次發(fā)現(xiàn)于成人骨髓中，曾命名為“MSCs、間充質(zhì)基質(zhì)細胞或多能基質(zhì)細胞”[1]。國際細胞治療學會根據(jù)其生物學特點制定了識別MSCs的最低標準，MSCs的特征為不表達 CD45、CD34、CD14或 CD11b、CD79α或 CD19、HLA-DR，并表達CD105、CD73和CD90的細胞，在體外可分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[2]。MSCs由于具有廣泛的增殖能力、多系分化能力、免疫調(diào)節(jié)作用和旁分泌活性等特性，且易與多種組織分離，在組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用前景。在組織損傷時，MSCs可通過直接植入目標組織或分化成熟組織起到組織修復功能。近年來的研究表明，MSCs除了具有多種分化能力外，可通過分泌生長因子、細胞因子和囊泡（如外泌體）來發(fā)揮其組織修復作用。這些分泌物統(tǒng)稱為分泌體。MSCs釋放大量生物活性因子（如細胞因子、趨化因子、生長因子和miRNAs等）。這些眾多的旁分泌因子構(gòu)成一個復雜網(wǎng)絡(luò)的一部分，賦予細胞穩(wěn)定性以及再生反應(yīng)的放大[3]，對局部細胞動力學產(chǎn)生深遠影響。因此，通過提供MSCs來促進旁分泌因子的生成，或直接給予MSCs的旁分泌因子，都構(gòu)成未來MSCs治療的基礎(chǔ)。

一、MSCs分泌功能

研究表明，成人MSCs的治療作用有80%以上是通過這種旁分泌介導來實現(xiàn)的。MSCs分泌的蛋白質(zhì)具有抗微生物、抗纖維化和促再生的作用，對細胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、創(chuàng)傷愈合及組織再生等過程都有作用[2,4]。MSCs分泌的各種因子被稱為分泌體，由多種細胞因子、趨化因子、血管生成因子和生長因子等組成[5]。該分泌體可影響局部微環(huán)境中其他細胞的活動和功能。MSCs產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1和胸腺肽B4等因子，對缺血心肌細胞具有一定的細胞保護作用[6]。此外，肝細胞生長因子、VEGF、基質(zhì)細胞衍生因子-1、 角質(zhì)化細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板生長因子、單核細胞趨化因子-1和胰島素樣生長因子-1等生長因子與細胞增殖和再生作用有關(guān)[7]。MSCs可通過增加抗炎因子[白細胞介素（interleukin，IL）-10、腫瘤壞死因子誘導蛋白6]和減少促炎癥因子（IL-1a、IL-6、IL-17、IFN-g、GCSF、GMCSF、MIP-2a、MCP- 1）而表現(xiàn)抗炎作用[8]。MSCs還能分泌VEGF-A和Ang1/Ang2，促進血管生成，其中，Ang 1/ Ang 2在新生血管的成熟過程中起作用，這些因素共同促進了傷口的愈合[8]。在急性腎損傷中，MSCs的保護作用是由于IL-10、堿性成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-α和B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）等抗炎和器官保護介質(zhì)的調(diào)節(jié)增強[9]。Tgel等[10]報道了在急性腎損傷模型中注射MSCs細胞治療，證實了促腎素-肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子的產(chǎn)生可以減少細胞凋亡，刺激腎上皮細胞的增殖，主要反映了MSCs的旁分泌功能。此外，在免疫應(yīng)答過程中，MSCs釋放的許多可溶性因子作用于免疫細胞，通過修復受損細胞或抑制免疫活性發(fā)揮作用。MSCs的免疫調(diào)節(jié)活性需要抗原呈遞細胞和T細胞分泌的炎性細胞因子，包括 IFN-γ，IL-1α，IL-1β 和 TNF-α，這些炎性細胞因子可激活MSCs分泌吲哚胺2,3-雙加氧酶，腫瘤壞死因子誘導蛋白6，一氧化氮，IL-10，CCL2，半乳糖凝集素，前列腺素E2和轉(zhuǎn)化生長因子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）等免疫抑制因子，從而調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)[11]。

二、MSCs來源的外泌體

MSCs除了分泌一系列的可溶性因子外，還可釋放大量的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVS），其內(nèi)容物被稱為“貨物分子”，通過質(zhì)譜、下一代測序和脂質(zhì)譜分析，可以推斷出它們的潛在功能[12-13]。EVS通常分為2個主要的亞群體，即外泌體和微囊泡。外泌體較小，大小為40 ～ 120 nm，起源于腔內(nèi)小室，多囊體內(nèi)囊泡通過胞吐而釋放。微囊泡較大，約200 ～ 1 000 nm，直接從質(zhì)膜萌發(fā)。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，EVS貨物分子由具有不同生物學性質(zhì)的分子組成，包括脂類（即膽固醇、鞘磷脂和己糖基）、蛋白質(zhì)（內(nèi)吞體相關(guān)蛋白、四超蛋白和脂質(zhì)Raft關(guān)聯(lián)蛋白以及離散蛋白負荷）、RNA亞型（即mRNA、miRNA、tRNA、rRNA、siRNA、lncRNA）和DNA亞型（即 mtDNA、ssDNA、dsDNA）[14-16]。MSCs-EVS免疫原性低，循環(huán)半衰期長，能穿越腦血屏障（BBB）；具有再生反應(yīng)媒介的潛在作用。含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA和DNA的EVS在生理和病理生理通訊過程中介導靶向細胞間信號傳遞[17-18]。EVS介導細胞與細胞通訊的機制包括：（1）通過信號復合物的作用刺激受體細胞；（2）將表面受體或脂類轉(zhuǎn)移到受體細胞；（3）通過胞內(nèi)途徑傳遞細胞質(zhì)蛋白和核酸；（4）通過膜融合傳遞細胞質(zhì)蛋白和核酸。

Raposo等[19]在1996年B淋巴母細胞的研究中，通過免疫電鏡證實含有主要組織相容復合物Ⅱ類分子（major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ）的內(nèi)膜囊泡可以轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜，并直接與質(zhì)膜融合，從而釋放MHCⅡ類分子，首次提供了關(guān)于EVS作為免疫生物學過程中信號傳遞媒介的第一個實驗證據(jù)。此后的研究發(fā)現(xiàn)EVS介導了各種免疫細胞類型之間以及腫瘤與免疫細胞之間的相互作用[20]。EVS具有將細胞內(nèi)的貨物分子轉(zhuǎn)移到靶細胞并誘導表型和行為改變的能力。此外，它們還能保護細胞質(zhì)成分免受化學物質(zhì)和酶的破壞或降解[21-22]。研究表明，MSCs來源的EVS與MSCs本身具有相似的治療活性。在大鼠急性腎損傷[23]以及缺血性心肌病[24]中發(fā)現(xiàn)MSCs來源的EVS具有抑制促炎癥過程，減少氧化應(yīng)激和纖維化的作用。此外，MSCs-EVS還具有抗凋亡、促進血管生成、促進神經(jīng)元存活和分化等功能[25-26]。盡管目前的研究認為MSCs-EVS抑制氧化應(yīng)激，促進血管生成，對組織特異性干細胞產(chǎn)生積極影響。但抑制促炎癥反應(yīng)仍是影響組織修復的最重要因素。在缺血性腦卒中模型中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)祖細胞不能有效地產(chǎn)生成熟的神經(jīng)細胞[27]，其原因與內(nèi)源性干細胞和祖細胞在炎癥環(huán)境下啟動再生過程受限有關(guān)。內(nèi)源性干細胞和祖細胞需要一個耐受性的環(huán)境來生存和促進再生。在細胞水平上， MSCs-EVS能夠?qū)⒕奘杉毎鸐1轉(zhuǎn)化為M2，M2巨噬細胞釋放的EVS能夠促進調(diào)節(jié)性T細胞的形成，增加IL-10和TGF-β等抑制性細胞因子產(chǎn)生，從而起到抗炎作用[28]。因此，通過將促炎癥轉(zhuǎn)化為耐受性環(huán)境，MSCs-EVS促進再生過程?？傊?，多項研究表明EVS至少可以部分再現(xiàn)MSCs治療所獲得的生物學效應(yīng)，MSCs-EVS的臨床應(yīng)用具有潛在的研究價值。

三、調(diào)控旁分泌因子發(fā)生和釋放的機制

近年來如何調(diào)節(jié)旁分泌因子的產(chǎn)生和釋放被越來越多的人關(guān)注。這包括2個方面：（1）什么樣的信息調(diào)節(jié)細胞旁分泌因子的表達；（2）控制蛋白質(zhì)或外泌體從細胞中釋放的機制。細胞信息傳遞和交換的方法之一是通過分泌這些因子（可溶性蛋白、外泌體和微囊泡），進而誘導受體細胞表型和功能的改變。在傳統(tǒng)的分泌途徑中，蛋白質(zhì)在高爾基體中分類，被運送到質(zhì)膜，并通過與質(zhì)膜的融合而釋放[29]。

早期研究表明，根據(jù)外界環(huán)境的刺激，MSCs以不同的方式釋放EVS，這一過程是通過MSCs與周圍微環(huán)境的相互作用來調(diào)節(jié)的。有研究證明，MSCs在缺氧或炎性條件作用下可調(diào)節(jié)EVS中貨物分子的成分，并影響其功能特性[30-31]。一些與MSCs所處的微環(huán)境相關(guān)途徑已經(jīng)被報道可調(diào)節(jié)EVS的生物發(fā)生和分泌。例如，腫瘤抑制物激活途徑6可調(diào)節(jié)EVS的形成，并受p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而促進EVS的產(chǎn)生[32]?？刂仆饷隗w貨物分子的生物發(fā)生和組成的機制尚不清楚。一種可能的分子機制是通過運輸所需的內(nèi)體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT），它在泛素化蛋白與外泌體的結(jié)合和分類中起著重要的作用[29]。細胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)Alix已被證明參與了細胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運和細胞骨架重塑[33]。研究報告表明，外泌體的生物發(fā)生是由連接Syndecans和Alix的syntenin控制的，這些組件蛋白刺激內(nèi)體膜出芽[34]。Alix與ESCRT的相互作用主要與外泌體胞內(nèi)負荷的積累有關(guān)。

參與外泌體釋放的結(jié)構(gòu)包括細胞骨架（肌動蛋白和微管）、分子馬達（驅(qū)動蛋白和肌球蛋白）、小GTPase和N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNAREs）[14]。外泌體是由p53調(diào)控的細胞胞吐作用釋放的，其生物發(fā)生依賴于細胞骨架的激活[35]?，F(xiàn)在具有挑戰(zhàn)性的研究是確定外泌體中包含哪些特定的生物活性因子，并闡明這種外泌體釋放和轉(zhuǎn)移的重要機制，實現(xiàn)EVS貨物分子的可操縱性，使其生物活性因子可特定和有效的交付給選定的目標細胞。

四、MSCs來源對旁分泌活性的影響

利用MSCs旁分泌活性進行治療的最關(guān)鍵因素是細胞本身的質(zhì)量和效力。由于不同組織來源的MSCs相似性和差異，它們對不同治療應(yīng)用的適用性是一個不斷爭論的話題。研究表明，來自不同組織來源的MSCs具有不同的分泌譜和不同的外泌體組合物[36]。

經(jīng)過分析了各種MSCs群體的分泌蛋白組，發(fā)現(xiàn)通常MSCs分泌體是包含ECM成分、免疫調(diào)節(jié)因子以及多種生長因子和細胞因子的混合物。不同組織來源的MSCs特異性比較研究證實，MSCs的旁分泌活性取決于細胞的起源。一項研究比較了骨髓（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BM）、脂 肪（adipose tissue-derived stromal cells，AD）和Wharton's Jelly來源的MSCs，發(fā)現(xiàn)Wharton's Jelly來源的MSCs分泌免疫調(diào)節(jié)因子最多，如IL-6、IL-7和IL-10以及血小板源生長因子-AA和TGF-β2，而AD-MSCs產(chǎn)生的ECM蛋白和酶更多，如膠原蛋白-1和-2和基質(zhì)金屬蛋白酶[37]。有研究發(fā)現(xiàn)在BM，AD和臍帶來源的MSCs群體中神經(jīng)調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生方面存在差異，BM旁分泌因子是減少氧化應(yīng)激最有利的治療來源，而AD和臍帶旁分泌因子則對抗興奮性毒性的保護作用更有利；此外，BM和hUM的分泌體作為抗凋亡制劑更具優(yōu)勢[36]。

胎兒與成人來源的MSCs在治療潛力上存在差異。胎兒MSCs所產(chǎn)生的因子本身既可以作為治療藥物，也可以作為旁分泌調(diào)節(jié)劑。在大鼠牽張成骨模型中，胚胎MSCs釋放的因子能夠減少MSCs的復制衰老，并比成人MSCs分泌體具有更強的促成骨作用[38]。MSCs的年齡和組織來源都提供了獨特的細胞表達，包括抑制性Kappa B激酶（IκB）、絲裂原活化蛋白激酶、核因子Kappa B（NFκB）、CD151、溶酶體膜蛋白1和溶酶體膜蛋白2的差異表達[39-41]。雖然對MSCs的年齡和來源變化的了解越來越多，但對影響該MSCs分泌體的因素了解有限。最近的研究表明隨著年齡的增加，MSCs外泌體的功能有所改變。最近的一項研究表明，MSCs外泌體表達功能性呼吸復合物Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ，這種復合物在受損的細胞中可消耗氧氣，并促進有氧ATP合成。然而，比較從≥37周齡新生兒（即足月兒）和28 ～ 30周齡新生兒（即早產(chǎn)兒）的臍帶MSCs培養(yǎng)物中分離出的外泌體，其ATP合成僅在足月新生兒的外泌體中檢測到，這提示了一種胎齡早期未完成的特定機制[42]。因此，這些發(fā)現(xiàn)提示MSCs外泌體產(chǎn)生包含另一層基于細胞年齡相關(guān)的復雜性差異。此外，MSCs的分化狀態(tài)對其旁分泌活性也有影響，在向成骨、軟骨和脂肪細胞分化過程中，MSCs分泌的蛋白質(zhì)組成發(fā)生了變化，這些變化中大多反映了這些細胞功能的變化。例如，Arufe等[43]表明，臍帶間質(zhì)來源MSCs分泌的蛋白質(zhì)在進行軟骨形成分化時發(fā)生了變化，在鑒定的342種不同蛋白中，17%是與軟骨形成相關(guān)的因子（例如MMP和ECM蛋白）。

目前，MSCs的旁分泌成分及其作用已成為組織再生研究的熱點，探討和發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞存活、增殖、分化或炎癥反應(yīng)的分泌體，對于組織修復具有重要意義。由于提取和收集相對困難，限制了對分泌體功能研究和分析。深入研究分泌體的產(chǎn)生和釋放機制，進一步優(yōu)化對MSCs的預(yù)處理方案和分泌體提取流程，將為獲得特定的分泌體提供機會。同時，加強分泌體作用的分子機制研究，探討MSCs旁分泌作用的治療潛力，將為許多疾病的干預(yù)提供了的新途徑。目前利用MSCs分泌的各種因子替代傳統(tǒng)的細胞療法，還需要更多的實驗研究及臨床實踐的論證。