張濤 惠定一 王顏剛

一、糖尿病皮膚損傷的發(fā)病特點(diǎn)

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組代謝紊亂綜合征，以高血糖為主要臨床表現(xiàn)[1]。隨著病程進(jìn)展，糖尿病可出現(xiàn)一系列并發(fā)癥。糖尿病患者皮膚易受內(nèi)源性及外源性的各種損傷，尤以合并酮癥酸中毒等急性應(yīng)激情況下更易受損，且損傷后創(chuàng)面遷延難愈，同時(shí)易繼發(fā)感染等，病變嚴(yán)重或處理不當(dāng)?？芍職?、致死，嚴(yán)重影響患者的疾病預(yù)后及生活質(zhì)量。約30%糖尿病患者在病程中可出現(xiàn)或伴發(fā)各種皮膚損傷，其發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，迄今尚無明確統(tǒng)一的結(jié)論，目前的總體研究提示，糖尿病皮膚損傷并非單因素的病理過程，血糖的慢性升高及代謝紊亂只是典型的特征之一[2-4]。

二、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）概述

MSCs是一類來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的成體多能干細(xì)胞。由Friedenstein等[5]于20世紀(jì)70年代年從骨髓中首先發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為這群細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下可向中胚層細(xì)胞即骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化，然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層包括干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌健、韌帶和骨髓基質(zhì)等分化發(fā)育的潛能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，從骨髓、臍帶血等多種組織中均可以提取并分離出MSCs，目前應(yīng)用研究較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）和人臍帶間充質(zhì) 干 細(xì) 胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）[7]。hUCMSCs有很強(qiáng)的“可塑性”，即能夠定向分化成機(jī)體內(nèi)的各種功能細(xì)胞、組織和器官。其增殖能力強(qiáng)，分化潛能大，免疫原性低，同時(shí)取材相對方便，也容易制備，而且沒有道德倫理問題的限制，由于存在以上諸多優(yōu)點(diǎn)，故臨床上有望成為最具前景的多能干細(xì)胞，成為近年來醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[8]。

三、MSCs治療糖尿病皮膚損傷研究現(xiàn)況

目前針對糖尿病皮膚損傷的傳統(tǒng)治療，主要包括控制血糖、血壓、血脂、體重，戒煙，適當(dāng)予以減輕水腫、控制感染、營養(yǎng)神經(jīng)、改善循環(huán)等措施，必要時(shí)予以清創(chuàng)、介入及截肢等措施，對于全身狀況較差、病變較嚴(yán)重者，往往療效不能令人滿意[9]。

MSCs治療糖尿病是一項(xiàng)近年新興且有廣泛應(yīng)用前景的新技術(shù)，將MSCs應(yīng)用于治療皮膚創(chuàng)傷的嘗試始于本世紀(jì)初。有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs有直接分化為血管細(xì)胞和相關(guān)支持細(xì)胞的能力，進(jìn)而可以促進(jìn)皮損的修復(fù)[10]。糖尿病慢性創(chuàng)口往往缺乏血供，局部供氧較差，值得一提的是，即使在缺氧的條件下，MSCs亦可迅速發(fā)起動(dòng)員，分泌多種生長因子以促進(jìn)組織生長和局部血管生成[11]。

Kuo等[12]應(yīng)用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)出40只雄性Wistar糖尿病大鼠，并建立背部皮膚缺損（6 cm×5 cm）模型，將其分為4組：Ⅰ組，非糖尿病大鼠（對照組）；Ⅱ組，不應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞的糖尿病對照組；第Ⅲ組，第7天每只接受一定MSCs的大鼠（在傷口邊緣周圍的8個(gè)區(qū)域皮下施用）；第Ⅳ組，第7天和第10天個(gè)接受上述治療量MSCs的大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)間內(nèi)，MSCs治療大鼠的傷口面積減少。與對照組相比，MSCs治療1次的大鼠的傷口愈合時(shí)間縮短，而MSCs治療2次的大鼠傷口愈合時(shí)間縮短更明顯。與對照組相比，組織學(xué)分析顯示MSCs治療組局部炎癥反應(yīng)減少；免疫組化分析顯示MSCs治療組相關(guān)生長因子如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、脯氨酰4-羥化酶和增殖細(xì)胞核抗原Ki-67的表達(dá)增加。該研究得出的結(jié)論是，MSCs能夠縮短糖尿病傷口愈合時(shí)間，并且這與它們改變局部組織的微環(huán)境及改變某些生物標(biāo)志物的表達(dá)有關(guān)。

Inoue等[13]通過研究，并應(yīng)用體內(nèi)發(fā)光成像（Bioimage）等技術(shù)，證實(shí)了BMSCs參與創(chuàng)傷修復(fù)與愈合的整個(gè)過程。該研究用STZ處理大鼠誘導(dǎo)糖尿病模型，在其頭部手術(shù)制成全層皮膚缺損，用BMMSCs浸漬的人造真皮覆蓋，使用免疫組織化等方法評估傷口愈合，并使用Bioimage技術(shù)確定移植的MSCs狀態(tài)。用MSCs浸漬的人造真皮處理的糖尿病鼠傷口小于術(shù)后1周單獨(dú)用人工真皮處理的糖尿病傷口。在愈合（3周）期間，在移植部位檢測到MSCs的光子，而僅在植入后1周，MSCs的細(xì)胞被耗盡。用MSCs處理的愈合部位的免疫組化顯示CD31+血管隨著VEGF的表達(dá)而增加，表明MSCs促進(jìn)血管生成。這些發(fā)現(xiàn)表明，在糖尿病大鼠模型的愈合過程中，移植的MSCs可以保留在傷口部位，促進(jìn)傷口愈合。

Khosravi等[14]應(yīng)用腹膜內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)成26只雄性Sprague-Dawley糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為2組，6周后，在每只大鼠的背部產(chǎn)生全層圓形切除傷口。將來自雄性大鼠腹部脂肪組織的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，AD-MSCs）溶于適量磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并在治療組皮膚周圍進(jìn)行注射治療。PBS用于對照組和非DM組。每隔1天測量傷口面積。傷口愈合完成后，從傷口部位采集全層皮膚樣本，用膠原纖維的體積密度，血管的長度和體積密度以及成體細(xì)胞的數(shù)值密度進(jìn)行立體觀察。結(jié)果：AD-MSCs注射加速了糖尿病大鼠的傷口愈合速度，但不增加血管的長度和體積密度以及膠原纖維的體積密度。該實(shí)驗(yàn)給出的結(jié)論：局部皮下注射AD-MSCs可以加快糖尿病大鼠的皮膚傷口愈合速度，但不是通過增加血管長度或密度，也不是通過積聚膠原纖維來實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)制尚未進(jìn)行進(jìn)一步研究。

Tark等[15]建立糖尿病模型小鼠，針對延遲愈合的創(chuàng)傷皮膚組織，分別應(yīng)用hUCMSCs局部皮膚注射和尾靜脈注射兩種方法加以干預(yù)，發(fā)現(xiàn)上述兩種方法對傷口的愈合的促進(jìn)均起到積極作用，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；后通過檢測細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，注射hUCMSCs后，皮損組織中VEGF及轉(zhuǎn)化生長因子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）含量增多，故推想MSCs促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的原因可能是局部組織某些生長因子的增多促進(jìn)了細(xì)胞增殖、組織再生，從而提高了創(chuàng)口的愈合的速度。

Kim等[16]將60只裸鼠隨機(jī)分配到Ia組（糖尿病對照組，n= 20），Ib組（糖尿病實(shí)驗(yàn)組，n= 20）和Ⅱ組（非糖尿病對照組，n= 20），在缺血性肢體產(chǎn)生后，Ib組局部注射AD- MSCs后3天、7天和25天后分別進(jìn)行組織學(xué)觀察和相關(guān)因子檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ia組動(dòng)物容易出現(xiàn)壞疽形成，導(dǎo)致較低的存活率。Ib組動(dòng)物早期具有豐富的新生血管形成和更好的組織重塑，存活率高。Ib組血漿和組織VEGF水平高于Ia組，與Ⅱ組相當(dāng)。這項(xiàng)研究證實(shí)了AD-MSCs對糖尿病裸鼠缺血性創(chuàng)傷愈合的有益效果，推想其可以通過旁分泌VEGF的方式促進(jìn)創(chuàng)口周圍組織新生血管的形成，進(jìn)而改善了糖尿病微血管損傷引起的微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，促進(jìn)了細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)了糖尿病患者皮膚組織缺損的愈合。

糖尿病足是糖尿病較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是因糖尿病血管病變和神經(jīng)病變等因素，導(dǎo)致糖尿病患者足部皮膚、皮下組織及肌肉組織等破壞（包括潰瘍、感染、組織壞死等）的一種病變[17-18]。糖尿病足通過常規(guī)的保守治療常常難以達(dá)到令人滿意的效果。

在國內(nèi)，王廣宇等[19]選取32例糖尿病足病患者，將hUCMSCs稀釋后行雙下肢肌肉內(nèi)注射，一段時(shí)間后評價(jià)其下肢缺血和周圍神經(jīng)病變的情況。結(jié)果顯示移植后6個(gè)月疼痛評分及冷感評分明顯改善，腓淺神經(jīng)、脛神經(jīng)感覺神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快，上述實(shí)驗(yàn)說明hUCMSCs可以改善糖尿病下肢缺血性病變及周圍神經(jīng)病變的臨床癥狀及某些客觀指標(biāo)。

Yu等[20]將 hUCMSCs制作成懸液 [細(xì)胞數(shù)（1 ～ 6）×1011個(gè)/L]，針對11例糖尿病足患者，給予多點(diǎn)（每點(diǎn)0.3 ～ 0.5 ml）肌肉注射到患側(cè)下肢的治療措施，通過后續(xù)的觀察發(fā)現(xiàn)，這些患者主觀的不適（如疼痛、麻木感及冷感等）較前明顯緩解，足部壞疽或潰瘍的創(chuàng)面有不同程度的縮小，有的甚至可以達(dá)到基本愈合的程度，這說明hUCMSCs的移植可能是一種簡單，安全和有效的治療方法，可有效增加下肢血流量，促進(jìn)潰瘍愈合，降低截肢率和截肢水平。此研究為糖尿病患者下肢缺血性病變的治療提供了新的思路。

四、MSCs治療糖尿病皮膚損傷方面的可能機(jī)制

（一）MSCs的分化及歸巢作用

MSCs具有強(qiáng)大的多能性，可以分化形成皮膚結(jié)構(gòu)，如上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和肌肉等附屬結(jié)構(gòu)，參與組織的再生與創(chuàng)面的修復(fù)，同時(shí)MSCs可以歸巢到損傷部位，在其中分化成相應(yīng)的組織細(xì)胞，進(jìn)而改善高血糖造成的各種損傷[21-22]。

（二）MSCs分泌生物活性物質(zhì)修復(fù)受損皮膚組織

最近研究表明：MSCs能在損傷部位分泌可溶性因子[23-24]，如肝細(xì)胞生長因子，白細(xì)胞介素-6，TGF-β，VEGF，血小板衍生生長因子等，改變組織血管微環(huán)境，提高損傷組織的再生能力，刺激上皮樣祖細(xì)胞的增殖、分化，減輕炎癥和免疫反應(yīng)，且這種作用已超過了其定向分化能力。MSCs分泌生物活性物質(zhì)的機(jī)制尚不完全明了，且多種細(xì)胞因子相互作用的機(jī)制仍進(jìn)一步探究。

（三）MSCs促進(jìn)新生血管的生成

血管內(nèi)皮細(xì)胞是干細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分，研究表明MSCs可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，表達(dá)其特異性的受體，通過自分泌促進(jìn)新生血管形成，改善相關(guān)并發(fā)癥癥狀；此外MSCs能夠合成和分泌EGF、VEGF、TGF-β等多種因子，這些活性因子通過旁分泌作用促進(jìn)血管新生[25]。VEGF是一種特異性內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂形成新生血管。EGF能動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)新生血管形成。

（四）MSCs的免疫抑制作用

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用。有研究表明，MSCs受到相關(guān)炎癥因子的刺激后，即可表現(xiàn)出很強(qiáng)的免疫抑制作用。免疫激活的T細(xì)胞釋放TNF-α及IL-1等細(xì)胞因子，刺激MSCs產(chǎn)生較多趨化因子和一氧化氮；前者招募T細(xì)胞向MSCs聚集，而后者抑制T細(xì)胞的增殖，產(chǎn)生免疫抑制效果[23]。

以上主要回顧了糖尿病皮膚損傷的特點(diǎn)，MSCs的生物學(xué)特性及其治療糖尿病皮膚損傷的進(jìn)展。雖然糖尿病皮膚損傷的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，治療上仍比較局限，但已經(jīng)有多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，MSCs在此方面的治療效果是可觀的，雖然這些研究對象多數(shù)為動(dòng)物（鼠類），而且目前MSCs在臨床應(yīng)用上仍然存在響應(yīng)率和安全性等問題，但相信隨著MSCs作用機(jī)制研究和臨床研究的不斷推進(jìn)，上述問題一定會(huì)逐步改善，MSCs在臨床治療上的前景將是非常廣闊，這必將給臨床帶來巨大福音，令人期待。