陳奇 孫翊夫 呂曉霞 張福強(qiáng) 顧銳 高旭 邵立偉 姜金蘭,

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）多見于創(chuàng)傷意外導(dǎo)致患者感覺運(yùn)動功能障礙甚至癱瘓，當(dāng)前臨床治療手段包括手術(shù)減壓固定，藥物治療，對癥支持治療及后期康復(fù)鍛煉[1]，但鑒于SCI復(fù)雜病理生理和人體相對不能修復(fù)或再生神經(jīng)細(xì)胞，所以當(dāng)前治療措施僅能減少殘存脊髓功能的繼續(xù)受損[2]。干細(xì)胞具有增殖和分化成各種組織器官的潛力，因此干細(xì)胞移植治療被認(rèn)為是修復(fù)SCI最有希望的方法[3]，其中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）與其他種類干細(xì)胞相比具有獲取容易，污染少，成本低且無倫理爭議的優(yōu)勢[4]。HUC-MSCs主要來源于臍帶華通氏膠[5]，是一種長梭形、核大、胞漿豐富的成纖維樣貼壁細(xì)胞，在特定條件下可向神經(jīng)細(xì)胞[6]、成骨細(xì)胞[7]、軟骨細(xì)胞[8]、脂肪細(xì)胞[9]和心肌細(xì)胞[10]等分化。HUC- MSCs表面高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（CD90、CD44、CD105、CD59等），而造血細(xì)胞標(biāo)志物（CD34、CD14、CD45、CD117等）不表達(dá)[11]，人白細(xì)胞抗原（HLA-DP、-DR、-DQ等）及免疫應(yīng)答相關(guān)表面抗原（CD40、CD80、CD86等）不表達(dá)或低表達(dá)，因此異體移植無排斥反應(yīng)或僅有較弱反應(yīng)[12]。正因這些獨特優(yōu)勢HUC-MSCs現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種再生醫(yī)學(xué)和組織工程方面，并且已經(jīng)從基礎(chǔ)研究逐步應(yīng)用于臨床治療[13]。

近年HUC-MSCs的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化技術(shù)不斷改進(jìn)。Li等[14]用一種新的三維系統(tǒng)構(gòu)建細(xì)胞生長復(fù)雜的微環(huán)境，使HUC-MSCs在無血清培養(yǎng)基生長形成球狀體并保持高活性增殖。三維系統(tǒng)較單層培養(yǎng)在相同體積內(nèi)獲得更多細(xì)胞，球狀體高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物且顯示出更強(qiáng)多能性。Salehinejad等[15]嘗試不同組合體外誘導(dǎo)HUC-MSCs分化成神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)將基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、成纖維細(xì)胞生長因子、視黃酸和表皮生長因子組合時誘導(dǎo)HUC-MSCs，其表達(dá)巢蛋白、β微管蛋白Ⅲ等神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物最多。另外Dehghani-Soltani等[16]發(fā)現(xiàn)將第3代HUC-MSCs經(jīng)發(fā)光二極管紅光和綠光照射后，經(jīng)過基因，蛋白質(zhì)和形態(tài)學(xué)水平的檢測證明其向神經(jīng)細(xì)胞分化，提示發(fā)光二極管照射和光遺傳學(xué)技術(shù)可用于再生醫(yī)學(xué)中的神經(jīng)分化和神經(jīng)修復(fù)。干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子[17]和抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[18]被認(rèn)為是干細(xì)胞移植治療SCI的基礎(chǔ)。

一、HUC-MSCs單獨移植治療SCI

Chen等[19]將來源于足月健康新生兒的HUC-MSCs培養(yǎng)至第5代，然后誘導(dǎo)分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞前體樣細(xì)胞，在制備SCI大鼠模型后1周將5 μl含有1×106個少突膠質(zhì)細(xì)胞前體樣細(xì)胞的鹽水注射移植至局部病損處，大鼠未行抗免疫排斥相關(guān)處理。移植8周后，生物素多聚葡聚糖胺追蹤發(fā)現(xiàn)SCI處皮質(zhì)脊髓束密度增加，免疫熒光染色證實再生髓鞘來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)；11周后，運(yùn)動功能評分（basso beattie bresnahan，BBB）顯示實驗組恢復(fù)最佳，整個過程未觀察到免疫排斥反應(yīng)，如呼吸困難、脫毛、猝死和活動異常等，證明HUC-MSCs分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞促進(jìn)脊髓軸突和髓鞘再生，改善神經(jīng)功能且免疫耐受性良好。Li等[20]觀察HUC-MSCs靜脈移植治療急性期SCI大鼠的療效，將培養(yǎng)至第3 ～ 4代的HUC-MSCs以1×106個細(xì)胞經(jīng)股靜脈移植，未使用任何免疫抑制劑。術(shù)后4周干細(xì)胞移植組BBB評分提示運(yùn)動功能恢復(fù)最好，神經(jīng)生長因子表達(dá)增加，白介素（interleukin，IL）-1β表達(dá)減少，所有大鼠均未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果顯示HUC-MSCs可以改善SCI病灶微環(huán)境，緩解繼發(fā)損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)且免疫耐受佳。Yang等[21]研究HUC-MSCs重復(fù)移植對兔雙節(jié)段SCI的療效，在兔SCI后1天通過耳緣靜脈以1次總劑量6×106或分3次劑量（間隔3 d）植入培養(yǎng)至3 ～ 5代的HUC-MSCs，未行抗免疫排斥處理。術(shù)后1 ～ 7周檢測干細(xì)胞移植組行為學(xué)評分顯示運(yùn)動功能提高，重復(fù)移植組前角運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目，體感誘發(fā)電位潛伏期及HUC-MSCs歸巢率等與單次移植組相比改善更佳，并且未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果提示兔功能恢復(fù)可能與干細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)、抑制細(xì)胞凋亡特性有關(guān)且多次重復(fù)移植效果更佳。此外Krupa等[22]局部移植HUC-MSCs治療SCI大鼠研究結(jié)果亦支持上述結(jié)論，Krupa觀察干細(xì)胞不同劑量（0.5×106或1.5×106個細(xì)胞）和重復(fù)鞘內(nèi)移植（第7天，第14天和第21天）療效，組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)隨著移植細(xì)胞劑量和應(yīng)用次數(shù)的增加，大鼠生長相關(guān)蛋白43+纖維數(shù)量增加且灰質(zhì)保留更多，巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和細(xì)胞凋亡減少，證明干細(xì)胞對脊髓再生影響是劑量依賴性的，可以通過反復(fù)應(yīng)用加強(qiáng)。

二、HUC-MSCs聯(lián)合移植治療SCI

SCI復(fù)雜病理生理及局部惡劣微環(huán)境以致任何單獨治療措施均不足以修復(fù)受損脊髓，因此干細(xì)胞與其他組分聯(lián)合移植治療SCI成為新興研究熱點[23]。通過聯(lián)合藥物，細(xì)胞因子，基因修飾技術(shù)，生物材料等移植，可充分發(fā)掘各組分之間協(xié)同作用，為治療SCI提供有利修復(fù)條件[24]。

Wang等[25]用槲皮素與HUC-MSCs聯(lián)合局部注射至大鼠SCI病損處，槲皮素是一種有抗氧化和清除自由基潛能的天然類黃酮。4周后聯(lián)合移植組大鼠BBB評分顯示更好的功能恢復(fù)，軸突變性減少，巨噬細(xì)胞極化增加，IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子降低，抗炎細(xì)胞因子IL-4，IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β1等增多，表明HUC-MSCs聯(lián)合槲皮素移植是減少SCI繼發(fā)損傷，促進(jìn)功能恢復(fù)的潛在途徑。Guo等[26]將HUC-MSCs體外誘導(dǎo)分化成雪旺氏細(xì)胞，與神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophin，NT）-3移植至SCI局灶病損處，NT-3對神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、存活及修復(fù)十分重要。結(jié)果提示聯(lián)合移植治療的大鼠運(yùn)動功能較其他組恢復(fù)更佳，損傷區(qū)域移植細(xì)胞存活率更高，病理程度破壞最少。白剛等[27]將NT-3基因轉(zhuǎn)染HUC-MSCs，促使其向神經(jīng)元分化并高表達(dá)NT-3，然后聯(lián)合基因沉默細(xì)胞因子抑制蛋白3治療脊髓全橫斷大鼠。術(shù)后檢測聯(lián)合治療組脊髓空洞減少，神經(jīng)電生理功能極大改善。細(xì)胞因子抑制蛋白3抑制內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)素并阻礙軸突再生，聯(lián)合基因修飾技術(shù)可以減少其對脊髓功能恢復(fù)的影響，但修飾基因是否穩(wěn)定表達(dá)及長期安全性如何仍需進(jìn)一步監(jiān)測。Jiao等[28]利用HUC-MSCs與絲素蛋白/海藻酸鹽/神經(jīng)營養(yǎng)因子復(fù)合支架聯(lián)合移植至SCI大鼠局部病灶處。絲素蛋白作為支架材料，改善細(xì)胞黏附遷移及增殖分化，海藻酸鹽作為神經(jīng)營養(yǎng)因子載體，絲素蛋白和海藻酸鹽結(jié)合使用改善神經(jīng)營養(yǎng)因子控制釋放。結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)標(biāo)志物IL-1β，IL-6、腫瘤壞死因子-α降低，神經(jīng)元標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2，神經(jīng)元核抗原及巢蛋白陽性細(xì)胞數(shù)目增加，表明HUCMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化趨勢增加。陳洪麗等[29]發(fā)現(xiàn)HUCMSCs體外培養(yǎng)時經(jīng)635 nm和雙波長弱激光作用后增殖速度加快，然后局部移植治療SCI大鼠。術(shù)后檢測IL-1、IL-6、神經(jīng)絲蛋白-200和膠質(zhì)纖維酸性蛋白分泌和表達(dá)增多，大鼠病損處纖維束互相交織且尼氏小體數(shù)目增加，原因可能與雙波長弱激光誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)水平較低，提高細(xì)胞抵抗能力有關(guān)。另外近年超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記的干細(xì)胞通過磁靶向系統(tǒng)匯聚至SCI局部成為熱點，這種聯(lián)合移植策略提高干細(xì)胞移植療效，未來有望應(yīng)用于臨床[30]。

三、移植途徑

干細(xì)胞移植途徑當(dāng)前主要包括局部病灶內(nèi)移植、靜脈途徑移植和蛛網(wǎng)膜下腔移植。局部病灶注射干細(xì)胞定植率高，但可能造成脊髓二次損傷降低療效[31]；靜脈途徑受血-腦（脊髓）屏障影響，細(xì)胞可能擴(kuò)散丟失較多[32]；而蛛網(wǎng)膜下腔注射將干細(xì)胞通過腦脊液循環(huán)抵達(dá)局部病損，不良事件較少發(fā)生[33]。劉雨亮等[34]取培養(yǎng)至第5代的HUC-MSCs制備成濃度為1×109個/L的細(xì)胞懸液，比較經(jīng)局部移植和靜脈途徑治療SCI大鼠的效果。移植4 ～ 12周后，兩組局部病損處可檢測到5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記的干細(xì)胞，大鼠BBB評分提示肢體運(yùn)動功能改善，蘇木精-伊紅染色顯示SCI處的空洞和瘢痕減少，并且靜脈移植組與局部移植組療效差異無統(tǒng)計學(xué)意義。靜脈途徑更加簡便，無局部移植的創(chuàng)傷、感染、出血等問題，但靜脈途徑需在SCI急性期血脊髓屏障通透性增加時進(jìn)行移植，細(xì)胞才能更多遷移到損傷部位。韓明遠(yuǎn)等[35]用來源于足月順產(chǎn)胎兒臍帶的HUC-MSCs體外培養(yǎng)至第5代，制備濃度為2×105個/μl細(xì)胞懸液，然后經(jīng)寰枕膜附近蛛網(wǎng)膜下腔注射5 μl的HUC-MSCs懸液治療SCI大鼠。12周后大鼠運(yùn)動功能和神經(jīng)電生理恢復(fù)均有改善，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)SCI局部病灶內(nèi)HUC-MSCs分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞并形成髓鞘，局部瘢痕減少且無不良事件出現(xiàn)，提示蛛網(wǎng)膜下腔注射是一種較為安全理想的方式，但由于不同移植次數(shù)、不同劑量及動物與人體的差異等因素可能影響效果，因此臨床應(yīng)采用何種移植途徑有待設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾S機(jī)對照試驗（randomized controlled trial，RCT）進(jìn)一步探索。

四、移植時間

SCI急性期炎癥反應(yīng)較重致局部微環(huán)境惡劣，不利于移植細(xì)胞存活，慢性期則膠質(zhì)瘢痕形成造成神經(jīng)修復(fù)困難[36]，因此探尋不同移植時間與SCI療效的關(guān)系至關(guān)重要。王穎等[37]根據(jù)大鼠SCI后不同時間移植分為3天組、1周組及3 周組，均通過局部注射途徑移植1×106個HUC-MSCs。結(jié)果顯示損傷后1周移植組后肢運(yùn)動功能恢復(fù)最佳，再生血管及神經(jīng)纖維數(shù)目也多于3天組和3周組，星形膠質(zhì)細(xì)胞向正常形態(tài)發(fā)展，并且病損處膠質(zhì)瘢痕減少。陳勝等[38]比較SCI大鼠不同時間移植干細(xì)胞的結(jié)果亦支持上述結(jié)論，陳勝等分別在大鼠SCI后3天、1周及3周于局部病損處注射移植1.2×106個HUC-MSCs。術(shù)后各組BBB評分提高，酶聯(lián)免疫吸附法檢測發(fā)現(xiàn)IL-2降低，IL-10增加，蘇木精- 伊紅染色提示損傷局部病理化程度減輕，并且以1周移植組恢復(fù)最佳，但人體解剖、損傷病理生理等與動物有較大差異，臨床患者適宜移植時間需要進(jìn)一步探索，而且臨床多為慢性SCI患者，當(dāng)錯過最佳移植時間應(yīng)如何針對性調(diào)整治療方案以實現(xiàn)個體化治療仍需深入研究。

五、HUC-MSCs治療SCI臨床應(yīng)用

隨著干細(xì)胞技術(shù)水平不斷發(fā)展進(jìn)步和動物實驗成效的鼓舞，HUC-MSCs移植逐漸應(yīng)用于臨床，至今有15篇文獻(xiàn)報道HUC-MSCs治療SCI患者的療效觀察[39-53]。

Cheng等[39]取足月健康新生兒臍帶來源的HUC- MSCs培養(yǎng)至第6 ～ 8代后制備成濃度為4×105個/μl細(xì)胞懸浮液，行局部移植治療病程在1年以上胸腰段慢性SCI患者。HUC- MSCs移植組10例患者CT引導(dǎo)下病灶處移植2 次 50 μl的細(xì)胞懸液，間隔 10 d，移植細(xì)胞數(shù)為 4×107，異體移植未行抗免疫排斥處理；康復(fù)組14例患者僅行康復(fù)理療。術(shù)后6個月使用美國脊髓損傷神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)，日常生活活動能力評分，尿動力學(xué)等評價療效。結(jié)果干細(xì)胞組10例患者中有7例患者在感覺運(yùn)動，自理能力，排尿功能方面有改善，所有患者未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，僅有1例出現(xiàn)放射性神經(jīng)痛，可能與局部移植針刺有關(guān)，而康復(fù)組的改善恢復(fù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明干細(xì)胞臨床應(yīng)用是安全有效的。張贊等[40]將受傷1 ～ 3年的30例慢性脊髓損傷患者分為兩組，觀察組15例SCI患者局部病損處移植來源于新生兒臍帶的HUC-MSCs，細(xì)胞濃度為8×105個/μl，異體移植未做抗免疫排斥處理；對照組15例患者行常規(guī)康復(fù)治療。6個月后，與術(shù)前及對照組相比，觀察組痛覺評分、觸覺評分、運(yùn)動評分、損傷分級均有改善，另外觀察組術(shù)后不良反應(yīng)出現(xiàn)發(fā)熱7例，低顱壓癥狀2例，腰腿痛4例，但癥狀均較輕，對癥處理后消失，未出現(xiàn)感染，腦脊液漏等并發(fā)癥，表明干細(xì)胞移植是安全的。劉靜等[41]長期隨訪觀察（平均84個月）35例慢性SCI患者（平均病程56個月）鞘內(nèi)移植HUC-MSCs的療效與安全性，每周1次注入10 ml劑量為1×106個/kg的HUC- MSCs懸液，1個療程為4周，異體移植未行抗免疫排斥處理。結(jié)果25例不完全SCI患者中22例在輕觸覺、針刺覺、運(yùn)動和日常生活活動能力評分均有提高，有效率達(dá)88%；另外10例完全SCI患者未有改善。術(shù)后有2例患者出現(xiàn)輕微低顱壓癥狀，考慮與腰穿有關(guān)，對癥處理后消失，未有與免疫排斥相關(guān)事件出現(xiàn)。另外Zhao等[42]將HUC-MSCs聯(lián)合一種新型膠原蛋白NeuroRegen支架用于臨床治療平均病程13.4個月的慢性SCI患者。首先顯微手術(shù)切除8例慢性完全性SCI患者的神經(jīng)瘢痕組織，然后將裝載4×107HUC-MSCs的NeuroRegen支架植入切除部位，異體移植未行抗免疫排斥相關(guān)處理。術(shù)后隨訪1年患者感覺水平和運(yùn)動誘發(fā)電位反應(yīng)區(qū)域增加，手指活動性增強(qiáng)，排便感覺和自主神經(jīng)功能改善未觀察到任何不良反應(yīng)。NeuroRegen支架可橋接損傷區(qū)域并抑制膠質(zhì)瘢痕組織再形成，干細(xì)胞黏附在纖維上的多個微小通道以減少植入過程的擴(kuò)散丟失，并且沿著纖維引導(dǎo)軸突生長，提示聯(lián)合生物材料支架裝載HUC-MSCs是一種潛在的治療慢性SCI方法。

六、總結(jié)與展望

隨著干細(xì)胞制備過程逐漸成熟，體外培養(yǎng)分化方法不斷改進(jìn)，神經(jīng)修復(fù)機(jī)制初步闡明，并在移植途徑、移植時間、聯(lián)合治療、臨床應(yīng)用有效性和安全性等方面進(jìn)行深入探索，使干細(xì)胞治療SCI的效果提高。尤其是聯(lián)合治療策略克服各種單一治療的劣勢，充分發(fā)掘各組分之間的協(xié)同作用，在SCI修復(fù)中呈現(xiàn)出巨大的潛力。

雖然HUC-MSCs移植治療SCI進(jìn)步較快，但依然面臨許多問題。首先，聯(lián)合治療種類繁多，干細(xì)胞聯(lián)合移植各組分之間應(yīng)尋找最佳搭配組合方案以發(fā)揮最大效應(yīng)；其次，目前臨床治療均為樣本較小的RCT和病例對照試驗，仍需大規(guī)模多中心的RCT驗證，并且當(dāng)前隨訪時間普遍僅有3個月～ 1年，而干細(xì)胞臨床治療的有效性及安全性需要長期監(jiān)測；然后SCI不同類型不同階段，完全性損傷、不完全性損傷、急性期、慢性期具有不同特點，如何調(diào)整治療方案以實現(xiàn)個體化精準(zhǔn)化治療有待探索。

未來應(yīng)著重于干細(xì)胞各項技術(shù)的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，提高體外培養(yǎng)分化效率，進(jìn)一步闡明神經(jīng)修復(fù)機(jī)制，繼續(xù)相關(guān)信號分子、傳導(dǎo)通路等基礎(chǔ)研究，并反復(fù)實踐不同治療策略以建立一套綜合治療方案體系，為干細(xì)胞在臨床上大規(guī)模應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。