許樹軍,鄒淑君,管慶霞

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

前 言

血清白蛋白是體內(nèi)小分子藥物運(yùn)輸?shù)闹匾d體，能夠與吸收入血的藥物發(fā)生特異性結(jié)合，結(jié)合能力的不同將決定藥物的藥效、選擇性和毒副作用。而內(nèi)源或外源共存物質(zhì)存在時(shí)往往影響藥物小分子與載體蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而影響其游離濃度和藥效[1]。金屬離子可直接影響藥物小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合，不同金屬離子對(duì)不同藥物小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合有減弱作用或增強(qiáng)作用[2]。槲皮素（Quercetin），結(jié)構(gòu)式見參考文獻(xiàn)[2]，是許多藥用植物中的重要藥效成分，存在于很多天然植物當(dāng)中，具有防止血小板凝聚、防治心血管疾病、增強(qiáng)免疫、抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗纖維化、抗炎等功能[4,5]。是應(yīng)用前景很好的小分子藥物。Cu2+是生物系統(tǒng)中一種獨(dú)特而有效的催化劑，是三十多種酶的活性成分，對(duì)人體的新陳代謝起著重要的作用[5]。血液中的Cu2+可能對(duì)藥物小分子實(shí)時(shí)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)通過熒光光譜法研究了Cu2+對(duì)槲皮素與BSA相互作用的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

PB-20型pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯儀器有限公司；RF-5301PC型熒光光度計(jì)：日本島津公司。

槲皮素：中國(guó)藥品生物制品檢定所；三羥甲基氨基甲烷（Tris 99.8%）：上海博宏生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA 99.8%）：美國(guó)Sigma公司。CuCl2·2H2O及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 溶液配制

以pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液為溶劑配制1×10-5mol·L-1的 BSA 溶液（內(nèi)含 0.01mol·L-1NaCl以維持溶液離子強(qiáng)度），置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?；稱取槲皮素，加少量甲醇溶解，再用二次蒸餾水定容獲得1×10-4mol·L-1的溶液；用二次蒸餾水溶解CuCl2·2H2O，配制成 1×10-3mol·L-1的氯化銅溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）在9個(gè)10mL容量瓶中均加入1.2中BSA溶液 1mL，再分別加入 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL的1.2中槲皮素溶液，用Tris-HCl緩沖液定容，搖勻。BSA濃度均為1.0×10-6mol·L-1，槲皮素的濃度分別是 0、1.0、2.0～8.0（×10-6mol·L-1）。

（2）在9個(gè)10mL容量瓶中均加入1.2中BSA溶液 1mL，再分別加入 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL的1.2中的CuCl2溶液，用Tris-HCl緩沖液定容，搖勻。BSA濃度均為 1.0×10-6mol·L-1，Cu2+的濃度分別是 0、1.0、2.0～8.0（×10-5mol·L-1）。

（3）另在10個(gè)10mL容量瓶中均加入1.2中BSA溶液1mL，2～10號(hào)容量瓶分別加入CuCl2溶液1mL，3～10 號(hào)容量瓶依次加入 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL的1.2中槲皮素溶液，用Tris-HCl緩沖液定容，搖勻。BSA濃度均為 1.0×10-6mol·L-1；Cu2+的濃度均為1.0×10-4mol·L-1，槲皮素的濃度分別是0、1.0、2.0～8.0（×10-6mol·L-1）。

（1）、（2）、（3）三組溶液各操作三次，分別在290K、300K、310K溫度下反應(yīng)20min。以280nm為激發(fā)波長(zhǎng)，入射狹縫5nm，發(fā)射狹縫3nm，掃描290～450nm范圍內(nèi)的熒光。

（4）數(shù)據(jù)分析及處理均參考文獻(xiàn)[2,6]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

圖1是300K溫度，280nm激發(fā)波長(zhǎng)，不同情況下BSA的熒光猝滅光譜圖。圖中A是固定BSA濃度，逐漸增加槲皮素濃度獲得的BSA的發(fā)射光譜；圖中B是固定BSA濃度，逐漸增加Cu2+濃度獲得的BSA的發(fā)射光譜?？梢姡珺SA在343nm處有最大發(fā)射峰，槲皮素和Cu2+均能夠降低BSA熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度，即對(duì)BSA的熒光產(chǎn)生猝滅作用。且隨著槲皮素或Cu2+濃度的增加，熒光猝滅峰出現(xiàn)規(guī)律性的降低，表明槲皮素和Cu2+均與BSA之間發(fā)生相互作用，但Cu2+對(duì)BSA的熒光猝滅能力比槲皮素弱得多。圖中C是Cu2+存在下，不同濃度的槲皮素對(duì)BSA的熒光猝滅作用?？梢姡珻u2+存在時(shí)，槲皮素仍然隨濃度的增大規(guī)律性地對(duì)BSA的熒光呈現(xiàn)猝滅能力。

圖1 不同情況下BSA的熒光光譜圖Fig.1 The fluorescence spectra of BSA under different conditions

2.2 猝滅機(jī)理及結(jié)合常數(shù)

BSA的熒光猝滅作用遵循Stern-Volmer方程，參考文獻(xiàn)[6,7]根據(jù)熒光猝滅光譜數(shù)據(jù)可以計(jì)算出動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq，如表1所示。表中Qct-BSA表示槲皮素與BSA結(jié)合，Cu-BSA表示Cu2+與BSA結(jié)合，Qct-Cu-BSA表示在Cu2+存在下的槲皮素與BSA結(jié)合。由表1可見，槲皮素對(duì)BSA的猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而降低，符合靜態(tài)猝滅規(guī)律。并且猝滅速率常數(shù)Kq均處于1012～1013數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞常數(shù) 2.0×1010L·mol-1·s-1。因此，認(rèn)定槲皮素對(duì)BSA的猝滅作用是生成復(fù)合物而產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅。Cu2+對(duì)BSA的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而升高，從這一點(diǎn)看符合動(dòng)態(tài)猝滅規(guī)律。但Kq處于1011數(shù)量級(jí)，大于2×1010，從這一點(diǎn)看符合靜態(tài)猝滅機(jī)理。結(jié)合文獻(xiàn)[5]推斷，Cu2+對(duì)BSA的熒光猝滅可能既有動(dòng)態(tài)猝滅也有靜態(tài)猝滅，但靜態(tài)猝滅占主導(dǎo)地位。由表1還可見到，在一定濃度的Cu2+存在下，逐步增加槲皮素的濃度，仍能對(duì)BSA的熒光產(chǎn)生規(guī)律性的猝滅，且Ksv隨著溫度的升高而降低，Kq均遠(yuǎn)大于 2.0×1010L·mol-1·s-1，因此，Cu2+存在時(shí)，槲皮素對(duì)BSA的熒光猝滅仍是生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

表1 三種情況下的作用參數(shù)Table 1 The action parameters under three kinds of circumstance

[6,7],以雙對(duì)數(shù)方程lg[（F0-F）/F]=lgKa+nlg[Q]計(jì)算結(jié)合常數(shù)KA，KA的計(jì)算結(jié)果見表1?？梢姡煌瑴囟认陆Y(jié)合常數(shù)存在KA（Qct-BSA）＞KA（Qct-Cu2+-BSA）＞KA（Cu2+-BSA）的關(guān)系。槲皮素與BSA的結(jié)合常數(shù)均處在104～106數(shù)量級(jí)，屬于強(qiáng)結(jié)合作用。Cu2+與BSA的結(jié)合常數(shù)只處在幾十L·mol-1的范圍，說明Cu2+與BSA結(jié)合程度較弱。在有Cu2+存在條件下，槲皮素與BSA結(jié)合常數(shù)大大降低，但仍屬于強(qiáng)結(jié)合作用。以上結(jié)果表明，Cu2+存在時(shí)，能夠增大槲皮素的非蛋白結(jié)合濃度。

2.3 作用力類型

借助Ross理論，結(jié)合參考文獻(xiàn)[6]，計(jì)算出不同情況下槲皮素與BSA作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)△G、ΔS及△H，見表2。三種情況下△G均為負(fù)值，反應(yīng)均能自發(fā)進(jìn)行。槲皮素與BSA的作用過程為△H＜0，ΔS＜0，表明槲皮素與BSA之間主要作用力類型是氫鍵和范德華力。Cu2+與BSA的作用過程為△H＞0，但接近于0，ΔS＞0，表明Cu2+與BSA之間主要作用力類型是疏水作用力，但靜電作用力不可忽略[8]。但是，當(dāng)Cu2+存在時(shí)，槲皮素與BSA的作用過程△G、△H、ΔS數(shù)值雖有變化，但仍為△H＜0，ΔS＜0，即主要作用力類型仍是氫鍵和范德華力。表明Cu2+存在，不會(huì)影響槲皮素與BSA之間的作用力類型。

表2 不同情況下相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 The thermodynamic parameters of interaction under different conditions

3 結(jié)論

結(jié)合文獻(xiàn)資料和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：Cu2+對(duì)BSA具有一定的熒光猝滅作用，且猝滅機(jī)理可能既有動(dòng)態(tài)猝滅也有靜態(tài)猝滅。盡管Cu2+本身對(duì)BSA的熒光有一定的猝滅作用，但在槲皮素與BSA的混合體系中，Cu2+的加入不改變槲皮素對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)理，仍是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅；不會(huì)改變槲皮素與BSA之間的作用力類型。只是使槲皮素與BSA的結(jié)合程度減小。這可能歸于兩方面原因共同作用的結(jié)果：一方面是槲皮素B環(huán)具有鄰位羥基，C環(huán)具有相鄰的羰基與羥基，具有較強(qiáng)的絡(luò)合作用，能夠與Cu2+形成絡(luò)合物，使槲皮素與BSA結(jié)合的有效位點(diǎn)減少；另一方面可能是由于Cu2+與BSA的結(jié)合作用使BSA變成受制狀態(tài)下的剛性肽鏈，改變了結(jié)合位點(diǎn)處的構(gòu)象，從而削弱了槲皮素與BSA的結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與研究Pb2+,Cu2+,Zn2+,Mg2+,Mn2+對(duì)另外幾種黃酮與血清蛋白結(jié)合的影響的結(jié)論相似[9]。該結(jié)論可為安全、合理使用藥用槲皮素提供理論指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn):

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