胡振儀 朱清華

染色體非整倍體異常是指細(xì)胞中因某條染色體增多或減少而形成的數(shù)目異?，F(xiàn)象，是造成胎兒出生缺陷的原因之一，其中帕陶氏綜合征（13-三體）、愛德華氏綜合征（18-三體）、唐氏綜合征（21-三體）、性染色體異常均是臨床常見的較為嚴(yán)重的染色體非整倍體異常疾?。?］。目前，臨床針對染色體非整倍體異常疾病的治療尚處于無法治療或難以治療階段，多以預(yù)防為主，產(chǎn)前診斷尤其是孕早期篩查是避免缺陷胎兒出生的主要手段［2］。以往產(chǎn)前診斷常用的方法有羊水穿刺、絨毛取樣、血清學(xué)篩查等，其中羊水穿刺、絨毛取樣具有較高的篩出率、但該類操作具有侵入有創(chuàng)性，會對胎兒帶來一定風(fēng)險；而血清學(xué)檢查雖較為安全，但其假陽性率較高，其臨床應(yīng)用均存在一定局限性［3］。近年來，利用孕婦外周血中少量的胎兒DNA進(jìn)行產(chǎn)前診斷已成為非侵入產(chǎn)前檢測的新方向，并取得較大突破［4］。本研究擬通過血清學(xué)檢測篩查出高風(fēng)險孕婦，對其進(jìn)行游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測，并對結(jié)果異常的孕婦進(jìn)一步進(jìn)行羊水穿刺檢查，最終以羊水結(jié)果和妊娠結(jié)局作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析血清學(xué)篩查聯(lián)合胎兒DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測在胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用價值，以期為臨床篩查提供參考，具體結(jié)果如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2015年4月至2017年3月孕周為15～20+6周在浙江省新昌其婦幼保健計劃生育服務(wù)中心進(jìn)行血清學(xué)游離雌三醇（Free estriol，μE3）、β-人絨毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin，βHCG）、人血清甲胎蛋白（Human serum alpha-fetoprotein，hAFP）水平三聯(lián)篩查的孕婦5822例作為研究對象，孕婦年齡22～35歲，平均（30.06±3.25）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕周＞15周者。（2）單胎妊娠者。（3）行正常產(chǎn)檢，資料記錄完整者。（4）本研究知情并簽署同意書者。（5）均隨訪至引產(chǎn)或分娩者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非自然受孕者。（2）孕婦自身為染色體異常。（3）惡性腫瘤患者。（4）孕婦近期有接受移植手術(shù)或干細(xì)胞治療。

1.2 方法 （1）血清學(xué)μE3、βHCG、hAFP水平三聯(lián)篩查：清晨空腹采集孕婦外周靜脈血3ml于抗凝管中，3500rpm離心10min，進(jìn)行μE3、βHCG、hAFP三聯(lián)篩查，孕周為15～20+6周。采用Multicalc軟件結(jié)合孕婦年齡、體質(zhì)量、末次月經(jīng)、是否使用胰島素等計算高位孕婦的風(fēng)險分割值，軟件輸入中對于月經(jīng)正常的按孕周算，月經(jīng)不正常的按雙頂徑算。其中21-三體綜合征的風(fēng)險分割值為1/270，18-三體綜合征的風(fēng)險分割值為1/350，均以超過風(fēng)險分割值為高風(fēng)險；單項指標(biāo)的正常參考值為μE3≥0.7 MOM，βHCG在 0.25～2.5 MOM 中間，hAFP參考范圍為 0.65～2.5 MOM。血清篩查高風(fēng)險的孕婦進(jìn)行無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測，低風(fēng)險的孕婦繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)孕期檢查。（2）無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測：選取血清學(xué)篩查顯示高風(fēng)險的孕婦在15～20孕周采用Streck管收集外周血10 ml，通過兩次離心（1600g、4℃離心10 min）分離孕婦外周血，采用磁珠法提取血漿中的胎兒游離DNA，對提取的DNA片段的末端進(jìn)行補(bǔ)平，通過接頭連接、文庫純化等方法建立樣品文庫，采用熒光定量PCR對文庫濃度進(jìn)行控制，合格后采用北京貝瑞和康公司的Nextseq CN500測序儀進(jìn)行上機(jī)測序，采用生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，獲取染色體所占比例Z值，計算公式為Z值=（待測樣本目標(biāo)染色體占整個基因組的百分比-正常組目標(biāo)染色體占整個基因組的百分比的平均值）/正常組目標(biāo)染色體占整個基因組的百分比的標(biāo)準(zhǔn)差，以Z值絕對值為3時作為風(fēng)險截斷值，＞3即認(rèn)為是染色體非整倍體高風(fēng)險孕婦。對篩查結(jié)果為高風(fēng)險的孕婦需進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)前侵入性診斷。（3）核型分析：選取無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測顯示為高風(fēng)險的孕婦，于孕17周后在B超引導(dǎo)下采用穿刺針經(jīng)腹壁進(jìn)行羊膜腔穿刺抽取羊水，并對羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用G顯帶技術(shù)對胎兒染色體進(jìn)行核型分析。

1.3 隨訪 根據(jù)孕婦產(chǎn)前檢測情況，核型分析顯示為染色體非整倍體異常的患者進(jìn)行引產(chǎn)終止妊娠，其余孕婦隨訪至分娩。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)三聯(lián)查篩查結(jié)果 5822例孕婦經(jīng)血清μE3、βHCG、hAFP三聯(lián)篩查，篩出高風(fēng)險241例（4.14%）；其中高風(fēng)險孕婦中21-三體高風(fēng)險孕婦196例（3.37%）、18-三體高風(fēng)險孕婦27例（0.46%），其它18例（0.31%）。

2.2 無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果 對血清三聯(lián)查顯示具有高風(fēng)險的孕婦241例進(jìn)行無創(chuàng)DNA檢測，結(jié)果顯示檢測值Z值＞3的有23例，其中21-三體陽性19例（0.33%）、18-三體陽性3例（0.05%）、13-三體陽性1例（0.02%）；其余檢測結(jié)果正常的218例孕婦隨訪至胎兒出生，隨訪結(jié)果顯示胎兒均無染色體異常。

2.3 染色體核型分析 23例無創(chuàng)DNA檢測篩查陽性病例均在孕婦及家屬同意的情況下，經(jīng)羊膜腔穿刺區(qū)穿刺獲得羊水后進(jìn)行胎兒核型分析，結(jié)果顯示22例（0.38%）患者存在染色體非整倍體異常，對其進(jìn)行引產(chǎn)終止妊娠，另外1例核型未發(fā)現(xiàn)異常分娩后顯示胎兒染色體正常。

2.4 血清學(xué)篩查與無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果比較 無創(chuàng)DNA檢測篩查出21-三體陽性、18-三體陽性、13-三體陽性所占血清學(xué)三聯(lián)合篩查高風(fēng)險結(jié)果的9.69%、11.11%、5.56%，整體占高風(fēng)險篩查人數(shù)的9.54%。

2.5 無創(chuàng)DNA檢測與核型分析結(jié)果比較 無創(chuàng)DNA檢測篩查出21-三體陽性、18-三體陽性、13-三體陽性與核型分析結(jié)果的一致率分別為94.74%、100.00%、100.00%，整體一致率為95.65%。

3 討論

出生缺陷是指胎兒在發(fā)育過程中出現(xiàn)的解剖學(xué)或功能學(xué)上的異常，主要包括先天性畸形、先天性智力低下、代謝障礙性疾病等［5］。目前研究顯示導(dǎo)致出生缺陷的原因較為復(fù)雜，多由環(huán)境因素和遺傳因素交互作用引起，其中染色體異常是常見的遺傳因素。孕期胎兒非整倍體染色體異常常導(dǎo)致死胎、死產(chǎn)甚至圍生期死亡等不良妊娠，即使胎兒存活下來也患有先天性結(jié)構(gòu)發(fā)育異?；蚬δ苋毕?，生存質(zhì)量相對較低，對母體造成沉重心理打擊的同時對家庭亦帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［6］。目前，臨床針對染色體非整倍異常的認(rèn)識相對較淺，尚無明確有效的治療手段，因此在孕期對胎兒染色體非整倍體異常進(jìn)行篩查是預(yù)防缺陷胎兒出生的最佳方法。相關(guān)研究報道顯示，孕中期是檢測胎兒染色體異常的最佳時機(jī)，該階段染色體異常篩出準(zhǔn)確性較高，但以往臨床常用的金標(biāo)準(zhǔn)檢測手段主要為羊膜穿刺、臍靜脈穿刺、絨毛活檢等侵入性產(chǎn)前診斷，易增加孕婦流產(chǎn)或胎兒感染的發(fā)生風(fēng)險［7-8］。因此，尋找同等有效但安全性高的非侵入性檢測手段成為臨床研究重點(diǎn)關(guān)注的問題之一。

母體血清學(xué)篩查方案是隨著μE3、βHCG、hAFP等與胎兒染色體異常相關(guān)的標(biāo)志發(fā)現(xiàn)而建立的，目前國內(nèi)用于妊娠中期的產(chǎn)前血清學(xué)篩查主要包括二聯(lián)查（μE3+βHCG）和三聯(lián)查（μE3+βHCG+AFP），其中三聯(lián)標(biāo)志物篩查方法的檢出率相對高于二聯(lián)標(biāo)志物篩查［9-10］。本研究首先采用三聯(lián)查方案對常規(guī)體檢孕婦進(jìn)行篩查，結(jié)果同樣顯示產(chǎn)前血清學(xué)三聯(lián)查篩出21-三體高風(fēng)險、18-三體高風(fēng)險及其他高風(fēng)險孕婦的檢出率分別為3.37%、0.46%、0.31%，后經(jīng)無創(chuàng)DNA分析顯示染色體非整體異常病例占高風(fēng)險篩查人數(shù)的9.54%，說明血清學(xué)篩查在染色體非整倍體異常的風(fēng)險評估中具有較高價值，能夠明顯提高染色體異常的產(chǎn)前篩查效率。但該方法受孕婦自身條件的限制較多，臨床篩查時假陽性率和假陰性率均較高，臨床多作為輔助診斷方案與其它方案進(jìn)行聯(lián)合篩查。

另外，對血清學(xué)篩查顯示高風(fēng)險的孕婦采用無創(chuàng)DNA檢測后21-三體、18-三體及13-三體陽性的檢出率為9.69%、11.11%、5.56%，后經(jīng)羊膜腔取羊膜細(xì)胞進(jìn)行核型分析后顯示無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果與核型分析結(jié)果在染色體非整倍體篩查時的一致性為95.65%，且對DNA檢測正常結(jié)果進(jìn)行隨訪，胎兒出生后均無染色體異常，假陰性率為0%，說明無創(chuàng)DNA檢測在診斷準(zhǔn)確率方面遠(yuǎn)高于血清學(xué)三聯(lián)合篩查，且樣本采集較傳統(tǒng)侵入性檢測更為方便安全，在胎兒染色體非整倍體診斷中具有較高的可行性。但無創(chuàng)DNA檢測的成本約為血清學(xué)篩查的10倍左右，不適用于孕婦常規(guī)產(chǎn)檢的大樣本篩查；同時Syngelaki等［11］指出無創(chuàng)DNA檢測在診斷21-三體、13-三體及18-三體3種染色體異常的診出靈敏度可達(dá)100%，但遺漏了其它染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，不能用于檢測染色體非平衡易位或缺失重復(fù)的異?，F(xiàn)象，因此其在臨床并不能完全替代血清學(xué)檢查和絨毛膜絨毛取樣檢查或羊水檢測等侵入性檢查。

綜上所述，產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體異常篩查應(yīng)采用血清學(xué)（μE3+βHCG+AFP）三聯(lián)查方案、胎兒游離DNA無創(chuàng)檢測、羊水細(xì)胞核型分析等多種診斷技術(shù)的聯(lián)合，取長補(bǔ)短，在最大限度降低篩查工作量和篩查成本的基礎(chǔ)上提高染色體非整倍體的檢出率，降低胎兒出生缺陷的發(fā)生率。