朱佳寧 薛靜

310009杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

·綜述·

胞外膜泡與系統(tǒng)性硬化病的關(guān)系及應(yīng)用展望

朱佳寧 薛靜

310009杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

胞外膜泡（extracellular vesicles）具有多種生理病理功能，可介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，參與炎癥、免疫信號(hào)通路、血管生成、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞衰老、增殖和分化等過程，在自身免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)、維持、調(diào)節(jié)中也起重要作用［1］。系統(tǒng)性硬化病（systemic sclerosis，SSc）是以皮膚纖維化、膠原增殖及血管病變?yōu)樘攸c(diǎn)的全身多系統(tǒng)自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)很大的異質(zhì)性，病理生理特征是內(nèi)皮細(xì)胞異常激活、凋亡以及血管生成細(xì)胞數(shù)量減少，使新血管的生成受損；以血管壁炎癥和凝血系統(tǒng)激活為特點(diǎn)的血管損傷在疾病的早期發(fā)生，并且是發(fā)病機(jī)制的核心［1?3］。本文旨在探討胞外膜泡在SSc病理機(jī)制中的作用及其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

一、概述

胞外膜泡主要包括兩種形式：直接從不同細(xì)胞的細(xì)胞膜脫落的微粒（cell?derived microparticles，microparticles）以及多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放的胞外體（exosomes）［1］。二者體積不同，形成機(jī)制及來源細(xì)胞各異，并在不同的生理或免疫環(huán)境中履行不同的生物學(xué)功能（表1）。

體內(nèi)微粒（100 nm～1 μm）可來源于許多不同種類細(xì)胞，較常見的有血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、樹突細(xì)胞等［1，4］。微粒往往來源于細(xì)胞膜的直接脫落，通常認(rèn)為其表達(dá)的膜成分磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl serine）是其一種特征性分子標(biāo)記物，參與凝血酶復(fù)合物的形成以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除衰老細(xì)胞的過程。也有研究發(fā)現(xiàn)，并非所有微粒均表達(dá)磷脂酰絲氨酸，說明其形成機(jī)制中仍有異質(zhì)性［1］。微粒的膜結(jié)構(gòu)成分還可反映其細(xì)胞來源，例如CD41（糖蛋白GpⅡb/Ⅲa）可特異性標(biāo)記血小板來源的微粒，CD235a（血型糖蛋白）標(biāo)記紅細(xì)胞來源的微粒；應(yīng)用針對(duì)微粒起源細(xì)胞表面特異性抗原成分的抗體也可識(shí)別其具體亞型，檢測(cè)微粒所包含的功能性細(xì)胞黏附因子、生物活性磷脂、胞質(zhì)成分和各種抗原也可證明其來源細(xì)胞以及接收的刺激類型［1］。目前最常用來檢測(cè)微粒的方法是流式細(xì)胞儀，主要優(yōu)勢(shì)是可對(duì)微粒所表達(dá)的生物標(biāo)志進(jìn)行雙標(biāo)或多標(biāo)染色以確定細(xì)胞來源及生物功能［5］。

胞外體（50～100 nm的囊泡）可以自發(fā)生成或由不同類型細(xì)胞接受各種刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，其生化結(jié)構(gòu)組成因細(xì)胞來源不同而呈現(xiàn)多樣性。已知的錨定在胞外體膜表面的分子除黏附分子、跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）、膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白和主要組織相容性復(fù)合體（MHC）外，也可含有伴侶蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、膜聯(lián)蛋白、多泡體形成相關(guān)蛋白、RNA（mRNA、microRNA）和代謝酶（3-磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸激酶）等。細(xì)胞分泌的胞外體具有在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)和核酸的功能，不僅在細(xì)胞間通訊中扮演了重要角色，同時(shí)在不同免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用，例如，從抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）脫落的某些細(xì)胞成分（如MHCⅠ、Ⅱ類復(fù)合物及相關(guān)多肽）被包被在胞外體內(nèi)，可轉(zhuǎn)移到其他樹突細(xì)胞或T細(xì)胞，參與進(jìn)一步免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)［1，6］。

表1 兩種胞外膜泡的主要性質(zhì)及功能對(duì)比

二、胞外膜泡與SSc

（一）微粒與SSc的關(guān)系：Guiducci等［4］研究發(fā)現(xiàn)，SSc患者血漿中微?？偭颗c改良的Rodnan皮膚厚度評(píng)分（MRSS）呈負(fù)相關(guān)，即微粒水平升高意味著SSc患者皮膚硬化程度較輕。伴有皮膚潰瘍的患者微?？偭匡@著降低，且多變量分析表明，微?？偭康淖儺惻c患者年齡、C反應(yīng)蛋白、MRSS評(píng)分、疾病亞型等相關(guān)。

有研究顯示，血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞來源的微粒血漿濃度在SSc患者中升高，且在合并有肺動(dòng)脈高壓或間質(zhì)性肺病的SSc患者中濃度更高［7］，反映出SSc患者中這些細(xì)胞被激活的同時(shí)釋放微粒，微粒含量可能與肺部受累及疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。Iversen等［8］應(yīng)用多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，血漿中可溶性E選擇素和P選擇素的增多與彌漫皮膚型SSc患者內(nèi)皮細(xì)胞來源的非結(jié)合膜聯(lián)蛋白V（AnxV）微粒有相關(guān)性，而與血漿總體微粒水平無關(guān)。另外，鑒于肺間質(zhì)病變?yōu)镾Sc中較為常見的內(nèi)臟病變，Iversen 等［9］還于另一研究中證實(shí)，局限皮膚型SSc及彌漫皮膚型SSc患者中內(nèi)皮細(xì)胞來源的AnxV陰性微粒和白細(xì)胞來源的AnxV陰性微粒的水平均與患者肺彌散功能、用力肺活量呈負(fù)相關(guān)，即與肺部受累嚴(yán)重度正相關(guān)，由此推測(cè)SSc患者中皮膚受累、肺部受累及其嚴(yán)重程度可能與微粒及相關(guān)細(xì)胞黏附分子（E、P選擇素）等表達(dá)相關(guān)。也有研究表明，上述總體微粒水平在SSc患者中降低，但AnxV陰性微粒水平有所增加［8］。推測(cè)SSc中檢測(cè)到總微粒減少的原因可能是微粒的清除增加或更多微粒黏附于有炎癥反應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞壁上；同時(shí)，胞外膜泡的提取、檢測(cè)及分析缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方法等也造成了這些研究結(jié)果的差異［1，7?8］。

1.血小板來源的微粒在SSc中的作用：血小板來源微粒是血液中微粒最常見類型［1，4］。不同類型細(xì)胞來源的微粒往往具有其母細(xì)胞特性，如血小板來源的微粒即具有血栓性和免疫學(xué)特性［10］。已有研究證據(jù)表明，血小板來源的微粒可能參與SSc發(fā)病機(jī)制，包括血管病變、內(nèi)皮細(xì)胞活化及凝血激活［8］。

研究發(fā)現(xiàn)，SSc患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多，激活細(xì)胞外高遷移率族蛋白1（HMGB1），也導(dǎo)致HMGB1從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞膜磷脂雙分子層的外層，釋放表達(dá)HMGB1的血小板來源微粒；同時(shí)HMGB1以可溶性分子形式與血小板膜或血小板來源微粒結(jié)合（HMGB1?微粒），直接或通過P選擇素反饋?zhàn)饔糜谥行粤＜?xì)胞，產(chǎn)生更多的ROS，進(jìn)而介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)、纖維化和血管炎癥等病理過程（圖1）［11?12］。

已知SSc患者血清HMGB1水平升高與疾病嚴(yán)重程度如內(nèi)臟器官受累及免疫學(xué)異常相關(guān)［13］；合并肺動(dòng)脈高壓或表現(xiàn)為彌漫進(jìn)展性皮膚受累的SSc患者白細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)合的HMGB1水平明顯增高，血小板來源微粒可作為SSc患者細(xì)胞壞死的原始信號(hào)HMGB1的來源，可能導(dǎo)致持續(xù)的微血管損傷和內(nèi)皮細(xì)胞激活［12，14?15］。

2.內(nèi)皮細(xì)胞來源的微粒在SSc中的作用：內(nèi)皮細(xì)胞來源微粒標(biāo)志著SSc患者分子水平的血管損傷，其不僅能反映內(nèi)皮組織的損傷或激活，同時(shí)也在炎癥調(diào)節(jié)、凝血過程和血管功能中發(fā)揮作用［2］。Kavian等［16］以此為依據(jù)對(duì)泛硫乙胺在SSc中的作用機(jī)制進(jìn)行了一系列研究并發(fā)現(xiàn)了一些潛在的治療SSc的新機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中，泛硫乙胺可下調(diào)腫瘤壞死因子（TNF）刺激的內(nèi)皮細(xì)胞釋放微粒，阻止微粒誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的氧化和硝化應(yīng)激（nitrosative stresses）反應(yīng)，還可修復(fù)SSc小鼠體內(nèi)分離出的成纖維細(xì)胞的氧化還原平衡；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，伴有皮膚和肺纖維化的SSc小鼠體內(nèi)循環(huán)的微粒、氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮損傷的標(biāo)記物水平升高，而使用泛硫乙胺或通過滅活三磷腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1可以抑制相關(guān)微粒的釋放從而改善SSc小鼠皮膚癥狀及病理?yè)p害程度。另外，富含花生四烯酸的微?？杀谎苌杉?xì)胞吞噬，繼而通過激活酸性鞘磷脂酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制該類細(xì)胞的吞噬作用或抑制酸性鞘磷脂酶可以阻止血管生成細(xì)胞被微粒誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)而促進(jìn)新生血管，抑制SSc相關(guān)的血管病變，因此也成為SSc可能的治療靶點(diǎn)之一［3］。

圖1 血小板及其來源的微粒、活性氧（ROS）、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、中性粒細(xì)胞之間的關(guān)系 血小板活化使表達(dá)HMGB1的血小板來源的微粒釋放，并通過P選擇素反饋?zhàn)饔糜谥行粤＜?xì)胞產(chǎn)生ROS；ROS氧化HMGB1，氧化形式的HMGB1激活中性粒細(xì)胞的能力增強(qiáng)，同時(shí)以可溶性分子的形式與血小板來源微粒結(jié)合，最終體內(nèi)增多的ROS介導(dǎo)系統(tǒng)性硬化病中自身免疫反應(yīng)、纖維化和血管炎癥

最近一項(xiàng)研究用熒光光學(xué)成像量化SSc患者手掌各關(guān)節(jié)的炎癥程度，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞微粒水平和熒光光學(xué)成像量化的血管周圍炎癥之間有明顯的相關(guān)性，推測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞微粒可能成為SSc患者的輔助診斷和治療監(jiān)測(cè)的潛在臨床標(biāo)志物［2］。

（二）胞外體與SSc的關(guān)系：胞外體與SSc發(fā)病機(jī)制關(guān)系更為密切，其表達(dá)的某些分子亞基可被自身抗體識(shí)別從而導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在SSc自身抗體譜研究中尤為重要。人類胞外體復(fù)合物（PM/Scl復(fù)合體）抗體屬于抗核仁抗體，主要表達(dá)在多發(fā)性肌炎-硬皮病重疊綜合征患者和相關(guān)疾病患者中［17?19］。主要的人類胞外體復(fù)合物抗原（PM/Scl?75和PM/Scl?100）的自身抗體可出現(xiàn)在SSc患者血清中，而這兩種自身抗體任一陽(yáng)性均提示臨床可能出現(xiàn)更嚴(yán)重的鈣質(zhì)沉著；PM/Scl?75和PM/Scl?100抗體雙陽(yáng)性的患者肌炎發(fā)生率增加；肺部受累則只與PM/Scl?75抗體相關(guān)，同時(shí)存在PM/Scl?100抗體的患者相對(duì)于其他抗體陽(yáng)性有更好的生存率［20］。研究證實(shí)，PM/Scl?75在細(xì)胞凋亡過程中被特異性裂解，裂解后的N端殘基保留了完整的RNase PH結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域即為人類胞外體復(fù)合物的核心。免疫系統(tǒng)持續(xù)接觸高水平的細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的裂解后PM/Scl?75，會(huì)破壞機(jī)體對(duì)胞外體復(fù)合物的免疫耐受，產(chǎn)生自身抗體如U1snRNP?68［17］，并引發(fā)全身各系統(tǒng)一系列的病態(tài)免疫應(yīng)答，因此胞外體形成是SSc免疫耐受失衡的重要機(jī)制之一。

如上所述，胞外體可表達(dá)的相關(guān)蛋白或分子較多，所有胞外體相關(guān)的蛋白質(zhì)（MPP6，C1D，KIAA0052/hMtr4，hSki2和hSki8）都可作為特異性靶向抗原，其中C1D抗體在多發(fā)性肌炎?硬皮病重疊綜合征患者血清中可被檢測(cè)，且識(shí)別C1D的自身抗體在多發(fā)性肌炎-硬皮病重疊綜合征患者中陽(yáng)性率與PM/Scl?75c和PM/Scl?100抗體陽(yáng)性率相近［21］。部分多發(fā)性肌炎?硬皮病重疊綜合征患者體內(nèi)可檢測(cè)到C1D抗體，但PM/Scl抗體陰性。使用重組C1D作為抗原靶向檢測(cè)自身抗體有助于多發(fā)性肌炎?硬皮病重疊綜合征的診斷［21］。因此，進(jìn)一步明確胞外體來源、性質(zhì)和與疾病特異性及其臨床亞型的關(guān)系，不僅有助于尋找疾病的標(biāo)記，也為進(jìn)一步尋找治療靶點(diǎn)提供幫助。

三、胞外膜泡的應(yīng)用展望

盡管微粒水平與SSc的相關(guān)性研究結(jié)果具有異質(zhì)性，但是血小板來源的微粒和內(nèi)皮細(xì)胞來源的微粒以及胞外體均在SSc的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，它們對(duì)于評(píng)估病情、判斷預(yù)后及發(fā)現(xiàn)可能的治療靶點(diǎn)均有潛在價(jià)值。

不同來源及標(biāo)記的胞外體行為學(xué)特征有較大的異質(zhì)性，可作為疾病生物標(biāo)志物、藥物作用靶點(diǎn)或藥物載體，在SSc中的應(yīng)用目前均尚屬初級(jí)探索階段，有著廣闊的發(fā)展前景。一些大型帶電分子的生物藥物不能跨越細(xì)胞膜到達(dá)作用靶點(diǎn)，而胞外體可以攜帶各種分子跨越生物屏障，如滑膜或血腦屏障，進(jìn)而達(dá)到靶向及精準(zhǔn)治療目標(biāo)［6］。與游離藥物相比，胞外體攜帶的藥物在血液中的形式更穩(wěn)定，且生物同源性保證了其安全性。

內(nèi)源性胞外膜泡可增強(qiáng)對(duì)外來抗原的免疫反應(yīng)，抑制針對(duì)自身抗原的反應(yīng)，因此APC來源的胞外膜泡或者從患者體內(nèi)分離出的內(nèi)源性胞外膜泡經(jīng)特定分子修飾后可用于治療自身免疫性疾病，為SSc治療提供新的思路和方法［22?23］。近年來胞外膜泡形成、釋放、被靶細(xì)胞攝取的分子機(jī)制被闡明，蛋白質(zhì)組學(xué)、下一代測(cè)序、代謝組學(xué)這些先進(jìn)技術(shù)都被用于研究胞外膜泡的結(jié)構(gòu)組成、蛋白質(zhì)翻譯后修飾等生物學(xué)性質(zhì)［1］。這些技術(shù)將進(jìn)一步帶動(dòng)胞外膜泡相關(guān)研究方法的標(biāo)準(zhǔn)化以及精準(zhǔn)性，更多的大樣本研究將更準(zhǔn)確地揭示各種類型胞外膜泡與SSc之間的關(guān)系，為其更好地應(yīng)用于臨床診治打下基礎(chǔ)。

［1］Turpin D,Truchetet ME,Faustin B,et al.Role of extracellular vesicles in autoimmune diseases［J］.Autoimmun Rev,2016,15（2）:174?183.DOI:10.1016/j.autrev.2015.11.004.

［2］Jung C,Drummer K,Oelzner P,et al.The association between endothelial microparticles and inflammation in patients with systemic sclerosis and Raynaud′s phenomenon as detected by functional imaging［J］.Clin Hemorheol Microcirc,2015,61（3）:549?557.DOI:10.3233/CH?151956.

［3］Distler JH,Akhmetshina A,Dees C,et al.Induction of apoptosis in circulating angiogenic cells by microparticles［J］.Arthritis Rheum,2011,63（7）:2067?2077.DOI:10.1002/art.30361.

［4］Guiducci S,Distler JH,Jüngel A,et al.The relationship between plasma microparticles and disease manifestations in patients with systemic sclerosis［J］.Arthritis Rheum,2008,58（9）:2845?2853.DOI:10.1002/art.23735.

［5］Nomura S,Niki M,Nisizawa T,et al.Microparticles as biomarkers of blood coagulation in cancer［J］.Biomark Cancer,2015,7:51?56.DOI:10.4137/BIC.S30347.

［6］Tran TH,Mattheolabakis G,Aldawsari H,et al.Exosomes as nanocarriers for immunotherapy of cancer and inflammatory diseases［J］.Clin Immunol,2015,160（1）:46?58.DOI:10.1016/j.clim.2015.03.021.

［7］Dunne JV,Bankole J,Keen KJ.Systematic review of the role of microparticles in systemic sclerosis［J］.Curr Rheumatol Rev,2013,9（4）:279?300.DOI:10.2174/1573397109666140103001139.

［8］Iversen LV,?stergaard O,Ullman S,et al.Circulating micropar?ticles and plasma levels of soluble E?and P?selectins in patients with systemic sclerosis［J］.Scand J Rheumatol,2013,42（6）:473?482.DOI:10.3109/03009742.2013.796403.

［9］Iversen LV,Ullman S,?stergaard O,et al.Cross?sectional study of soluble selectins,fractions of circulating microparticles and their relationship to lung and skin involvement in systemic sclerosis［J］.BMC Musculoskelet Disord,2015,16:191.DOI:10.1186/s12891?015?0653?8.

［10］Oyabu C,Morinobu A,Sugiyama D,et al.Plasma platelet?derived microparticles in patients with connective tissue diseases［J］.J Rheumatol,2011,38（4）:680?684.DOI:10.3899/jrheum.100780.

［11］Bourji K,Meyer A,Chatelus E,et al.High reactive oxygen species in fibrotic and nonfibrotic skin of patients with diffuse cutaneous systemic sclerosis［J］.Free RadicBiol Med,2015,87:282 ?289.DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2015.07.002.

［12］Maugeri N,Rovere?Querini P,Baldini M,et al.Oxidative stress elicits platelet/leukocyte inflammatory interactions via HMGB1:a candidate for microvessel injury in sytemicsclerosis［J］.Antioxid Redox Signal,2014,20（7）:1060?1074.DOI:10.1089/ars.2013.5298.

［13］Yoshizaki A,Komura K,Iwata Y,et al.Clinical significance of serum HMGB?1 and sRAGE levels in systemic sclerosis:association with disease severity［J］.J ClinImmunol,2009,29（2）:180?189.DOI:10.1007/s10875?008?9252?x.

［14］Maugeri N,Franchini S,Campana L,et al.Circulating platelets as a source of the damage?associated molecular pattern HMGB1 in patients with systemic sclerosis［J］.Autoimmunity,2012,45（8）:584?587.DOI:10.3109/08916934.2012.719946.

［15］Ayer LM,Sénecal JL,Martin L,et al.Antibodies to high mobility group proteins in systemic sclerosis［J］.J Rheumatol,1994,21（11）:2071?2075.

［16］Kavian N,Marut W,Servettaz A,et al.Pantethine prevents murine systemic sclerosis through the inhibition of microparticle shedding［J］.Arthritis Rheumatol,2015,67（7）:1881 ?1890.DOI:10.1002/art.39121.

［17］Schilders G,Raijmakers R,Malmegrim KC,et al.Caspase?mediated cleavage of the exosome subunit PM/Scl?75 during apoptosis［J］.Arthritis Res Ther,2007,9（1）:R12.DOI:10.1186/ar2119.

［18］Mahler M,Raijmakers R.Novel aspects of autoantibodies to the PM/Scl complex:clinical,genetic and diagnostic insights［J］.Autoimmun Rev,2007,6（7）:432 ?437.DOI:10.1016/j.autrev.2007.01.013.

［19］Mahler M,Fritzler MJ.PM1?Alpha ELISA:the assay of choice for the detection of anti?PM/Scl autoantibodies?［J］.Autoimmun Rev,2009,8（5）:373?378.DOI:10.1016/j.autrev.2008.12.001.

［20］Wodkowski M,Hudson M,Proudman S,et al.Clinical correlates of monospecific anti?PM75 and anti?PM100 antibodies in a tri?nation cohort of 1574 systemic sclerosis subjects ［J］.Autoimmunity,2015,48（8）:542?551.DOI:10.3109/08916934.2015.1077231.

［21］Schilders G,Egberts WV,Raijmakers R,et al.C1D is a major autoantibody target in patients with the polymyositis?scleroderma overlap syndrome［J］.Arthritis Rheum,2007,56（7）:2449?2454.DOI:10.1002/art.22710.

［22］Robbins PD,Dorronsoro A,Booker CN.Regulation of chronic inflammatory and immune processes by extracellular vesicles［J］.J Clin Invest,2016,126（4）:1173?1180.DOI:10.1172/JCI81131.

［23］De Toro J,Herschlik L,Waldner C,et al.Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions:new insights for diagnosis and therapeutic applications［J］.Front Immunol,2015,6:203.DOI:10.3389/fimmu.2015.00203.

薛靜，Email：jingxue@zju.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金（81102264）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2018KY422）

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.023

2016?12?06）

朱思維 顏艷）