袁 崗 肖宗宇 李文輝 曹立新 惠超杰 （青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西寧 810001）

血管外膜成纖維細(xì)胞是組成血管外膜的主要成分，抑制血管外膜成纖維細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡對(duì)防治心血管疾病具有重要作用［1-3］。IFN-α可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4］。目前關(guān)于人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的分子機(jī)制尚未完全闡明，因而探究其分子機(jī)制及積極探尋心腦血管增殖性疾病的治療藥物具有重要意義。研究表明尼莫地平可抑制谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞增殖［5］。胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）表達(dá)上調(diào)可能改善人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及促進(jìn)細(xì)胞增殖［6］。但尼莫地平是否可通過(guò)調(diào)控IRS-1 的表達(dá)從而影響人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力及凋亡尚未可知。因此，本研究主要探討尼莫地平對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力、凋亡的影響及其對(duì)IRS-1 的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人腦血管外膜成纖維細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。

1.1.2 藥品與試劑 尼莫地平，含量/規(guī)格：50 ml/10 mg，生產(chǎn)批號(hào)：J20140105，購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司；IFN-α 購(gòu)自北京三元基因工程有限公司；DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；MTT、DMSO 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine2000與Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；si-IRS-1、si-con購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔抗人p21、CyclinD1 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；兔抗人Bax、Cleaved caspase-3、Bcl-2 抗 體 購(gòu) 自 美 國(guó)Santa Cruz 公司；兔抗人IRS-1 抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。

1.1.3 儀器 7500 型ABI 熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 NC 組：正常培養(yǎng)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞；IFN-α 組：用2×106U/L IFN-α 培養(yǎng)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞；共同處理組：人腦血管外膜成纖維細(xì)胞分為IFN-α+Nimo 50 μg/ml組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml 組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 組，其中IFN-α 濃度為2×106U/L［7］，尼莫地平濃度分別為50、100、200 μg/ml［8］。后續(xù)研究將人腦血管外膜成纖維細(xì)胞分為IFN-α+pcDNA 組、IFN-α+pcDNA-IRS-1組、IFN-α+Nimo+si-con組、IFN-α+Nimo+si-IRS-1組，其中尼莫地平濃度為200 μg/ml，IFN-α 濃度為2×106U/L。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力［9］收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人腦血管外膜成纖維細(xì)胞接種至96 孔板（5×103個(gè)/孔），分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h 時(shí)加入MTT 試劑（20 μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO（150 μl/孔），檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm 處的相對(duì)吸光度（OD）值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率［10］收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人腦血管外膜成纖維細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌，4 ℃、3 000 r/min 離心6 min，棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中IRS-1 mRNA 的表達(dá)水平［11］采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，參照試劑盒說(shuō)明書計(jì)算IRS-1 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)IRS-1、p21、Bax、Cleaved caspase-3、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)［12］提取各組細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，孵育（IRS-1 稀釋比1∶800、p21 稀釋比1∶1 000、Bax 稀釋比1∶1 000、Cleaved caspase-3 稀釋比1∶1 000、CyclinD1 稀釋比1∶800、Bcl-2 稀釋比1∶800）一抗稀釋液，孵育IgG 稀釋液（1∶5 000），TBST 洗滌，滴加ECL，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以±s表示，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼莫地平對(duì)IFN-α 對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力的影響 與NC 組比較，IFN-α 組細(xì)胞活力降低（P<0.05），p21 蛋白水平升高（P<0.05），CyclinD1蛋白水平降低（P<0.05）；與IFN-α 組比較，IFN-α+Nimo 50 μg/ml組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml組細(xì)胞活力升高（P<0.05），p21蛋白水平降低（P<0.05），CyclinD1 蛋白水平升高（P<0.05），見(jiàn)圖1、表1。

表1 尼莫地平對(duì)IFN-α對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力（±s，n=3）Tab.1 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表1 尼莫地平對(duì)IFN-α對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力（±s，n=3）Tab.1 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

Cell viability/%Groups p21 CyclinD1 48 h 0.74±0.06 0.45±0.031）0.53±0.042）0.61±0.052）0.66±0.042）18.632 0.000 72 h 1.16±0.09 0.71±0.071）0.88±0.062）0.96±0.082）1.03±0.112）12.081 0.001 NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml F P 0.15±0.04 0.67±0.061）0.48±0.052）0.45±0.052）0.32±0.042）45.581 0.000 0.74±0.04 0.22±0.031）0.35±0.042）0.48±0.062）0.54±0.072）46.048 0.000 24 h 0.32±0.04 0.29±0.03 0.32±0.03 0.30±0.04 0.31±0.04 0.386 0.814

圖1 Western blot 檢測(cè)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞中p21和CyclinD1蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot was used to detect p21 and CyclinD1 protein expressions in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.2 尼莫地平對(duì)IFN-α 對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響 與NC 組比較，IFN-α 組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05），Bax、Cleaved caspase-3 蛋白水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05）；與IFN-α組 比 較，IFN-α+Nimo 50 μg/ml 組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml 組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），Bax、Cleaved caspase-3 蛋白水平降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），見(jiàn)圖2、表2。

表2 尼莫地平對(duì)IFN-α對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.2 Effects of nimodipine on IFN-α on Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expressions and apoptosis of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表2 尼莫地平對(duì)IFN-α對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.2 Effects of nimodipine on IFN-α on Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expressions and apoptosis of human cerebral adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

Cell apoptosis rate/%3.51±0.32 21.84±2.231）14.39±1.152）9.18±1.032）8.37±0.942）87.331 0.000 Groups NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml FP Bax 0.25±0.03 0.72±0.071）0.58±0.062）0.48±0.052）0.43±0.052）31.844 0.000 Bcl-2 0.64±0.04 0.25±0.031）0.37±0.042）0.46±0.052）0.52±0.052）36.049 0.000 Cleaved caspase-3 0.13±0.02 0.67±0.061）0.51±0.052）0.38±0.042）0.28±0.042）66.696 0.000

圖2 Western blot 檢測(cè)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot was used to detect protein expressions of Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.3 尼莫地平對(duì)IFN-α 對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞IRS-1 表達(dá)的影響 與NC 組比較，IFN-α 組IRS-1 mRNA 及蛋白水平降低（P<0.05）；與IFN-α 組比較，IFN-α+Nimo 50 μg/ml組、IFN-α+Nimo 100 μg/ml組、IFN-α+Nimo 200 μg/ml 組IRS-1 mRNA 及蛋白水平升高（P<0.05），見(jiàn)圖3、表3。

表3 尼莫地平對(duì)IFN-α 對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of nimodipine on IFN-α on IRS-1 mRNA and protein expression of human cerebral adventi?tia fibroblasts（±s，n=3）

表3 尼莫地平對(duì)IFN-α 對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of nimodipine on IFN-α on IRS-1 mRNA and protein expression of human cerebral adventi?tia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with IFN-α group，2）P<0.05.

IRS-1 protein 0.67±0.06 0.19±0.031）0.33±0.042）0.47±0.052）0.59±0.062）46.230 0.000 Groups NC IFN-α IFN-α+Nimo 50 μg/ml IFN-α+Nimo 100 μg/ml IFN-α+Nimo 200 μg/ml FP IRS-1 mRNA 1.05±0.08 0.21±0.031）0.42±0.052）0.73±0.082）0.87±0.092）71.160 0.000

圖3 Western blot 檢測(cè)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞中IRS-1蛋白表達(dá)Fig.3 Western blot was used to detect expression of IRS-1 protein in human cerebral vascular adventitia fibroblasts

2.4 過(guò)表達(dá)IRS-1對(duì)IFN-α對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力和凋亡的影響 與IFN-α+pcDNA 組比較，IFN-α+pcDNA-IRS-1 組細(xì)胞活力升高（P<0.05），細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05），p21、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平降低（P<0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），見(jiàn)圖4、表4。

圖4 人腦血管外膜成纖維細(xì)胞中IRS-1、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Protein expressions of IRS-1，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2，Cleaved caspase-3 and apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts

表4 過(guò)表達(dá)IRS-1 對(duì)IFN-α 對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.4 Effect of overexpression of IRS-1 on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 pro?tein expressions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表4 過(guò)表達(dá)IRS-1 對(duì)IFN-α 對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.4 Effect of overexpression of IRS-1 on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 pro?tein expressions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with IFN-α+pcDNA group，1）P<0.05.

Cell apopto?sis rate/%20.754±2.07 11.35±1.431）6.474 0.003 Groups IRS-1 p21 CyclinD1 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 0.65±0.05 0.41±0.041）6.492 0.014 Cell viability/%24 h 0.31±0.04 0.34±0.03 1.039 0.357 48 h 0.54±0.04 0.67±0.051）3.517 0.025 72 h 0.76±0.06 1.04±0.071）5.260 0.006 IFN-α+pcDNA IFN-α+pcDNA-IRS-1 t P 0.38±0.04 0.52±0.051）3.787 0.019 0.74±0.06 0.41±0.041）7.926 0.001 0.32±0.04 0.58±0.051）7.033 0.001 0.64±0.06 0.25±0.031）10.070 0.000 0.27±0.04 0.43±0.051）4.328 0.028

2.5 沉默IRS-1 部分逆轉(zhuǎn)尼莫地平對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞的作用 與IFN-α+Nimo+si-con 組比較，IFN-α+Nimo+si-IRS-1 組細(xì)胞 活力降 低（P<0.05），細(xì) 胞 凋 亡 率 升 高（P<0.05），p21、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平升高（P<0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05），見(jiàn)圖5、表5。

圖5 人腦血管外膜成纖維細(xì)胞中IRS-1、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2 和Cleaved caspase-3 蛋 白表達(dá)及維細(xì)胞凋亡情況Fig.5 Protein expressions of IRS-1，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 and apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts

表5 尼莫地平對(duì)IFN-α對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.5 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expres?sions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

表5 尼莫地平對(duì)IFN-α對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力、p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Tab.5 Effects of nimodipine on IFN-α on cell viability，p21，CyclinD1，Bax，Bcl-2 and Cleaved caspase-3 protein expres?sions and cell apoptosis of human cerebral vascular adventitia fibroblasts（±s，n=3）

Note：Compared with IFN-α+Nimo+si-con group，1）P<0.05.

Cell apopto?sis rate/%10.75±1.08 15.36±1.251）4.834 0.008 Groups IRS-1 p21 CyclinD1 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 0.23±0.02 0.41±0.041）6.971 0.002 Cell viability/%24 h 0.34±0.04 0.31±0.03 1.039 0.357 48 h 0.72±0.05 0.61±0.041）2.976 0.041 72 h 1.03±0.09 0.79±0.061）3.843 0.018 IFN-α+Nimo+si-con IFN-α+Nimo+si-IRS-1 t P 0.67±0.06 0.45±0.051）4.879 0.008 0.31±0.04 0.49±0.061）4.323 0.012 0.54±0.05 0.25±0.031）8.614 0.001 0.31±0.04 0.75±0.031）15.242 0.000 0.71±0.08 0.36±0.031）7.095 0.002

3 討論

血管增殖性疾病與血管重構(gòu)的發(fā)展有關(guān)，而人腦血管外膜成纖維細(xì)胞與心腦血管疾病密切相關(guān)［13-14］。但仍有部分藥物對(duì)血管增殖性疾病的治療及其作用機(jī)制尚未闡明。

尼莫地平可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而減輕神經(jīng)功能損傷［15］。尼莫地平可保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，其作用機(jī)制可能是抑制炎癥因子表達(dá)而發(fā)揮作用［16］。尼莫地平能夠降低炎癥因子水平而減輕炎癥反應(yīng)從而恢復(fù)神經(jīng)功能［17］。但尼莫地平在治療神經(jīng)相關(guān)疾病中的作用機(jī)制尚未完全闡明，本研究結(jié)果顯示IFN-α 處理后人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力降低，與上述研究結(jié)果相似，而不同濃度的尼莫地平處理后細(xì)胞活力升高，提示尼莫地平可增強(qiáng)IFN-α誘導(dǎo)的腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力。本研究結(jié)果顯示IFN-α 處理后腦血管外膜成纖維細(xì)胞中p21 表達(dá)上調(diào)，CyclinD1表達(dá)下調(diào)，而不同濃度的尼莫地平處理后p21 表達(dá)下調(diào)，CyclinD1 表達(dá)上調(diào)，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果相似，提示尼莫地平可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期從而增強(qiáng)腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力［18］。本研究結(jié)果顯示IFN-α 處理后腦血管外膜成纖維細(xì)胞凋亡率升高，Bax、Cleaved caspase-3 表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，而尼莫地平處理后細(xì)胞凋亡率降低，Bax、Cleaved caspase-3 表達(dá)下調(diào)，Bcl-2 表達(dá)上調(diào)，提示尼莫地平可抑制腦血管外膜成纖維細(xì)胞凋亡。

miR-126 可通過(guò)靶向IRS-1 而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌作用［19］。本研究結(jié)果顯示IFN-α 處理后腦血管外膜成纖維細(xì)胞中IRS-1 表達(dá)下調(diào)，尼莫地平處理后可促進(jìn)IRS-1 的表達(dá)，進(jìn)一步分析顯示IRS-1過(guò)表達(dá)后細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，p21、Bax、Cleaved caspase-3 表 達(dá) 下 調(diào)，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)上調(diào)，提示IRS-1 過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞活力及抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究結(jié)果顯示抑制IRS-1 的表達(dá)后，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，提示抑制IRS-1 的表達(dá)可明顯減弱尼莫地平對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞的作用。

綜上所述，尼莫地平可增強(qiáng)IFN-α 誘導(dǎo)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力及抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)IRS-1 的表達(dá)有關(guān)，可為尼莫地平治療血管增殖性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。