龍劍文 羅晶 尹緒文 衛(wèi)靜 賀琪 李恒 石全 皮先明

430061武漢，湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院皮膚科［龍劍文（現(xiàn)在湖北省中醫(yī)院皮膚科，430061武漢）］；湖北省中醫(yī)院皮膚科（羅晶、尹緒文、衛(wèi)靜、賀琪、李恒、石全、皮先明）

·論著·

重樓皂苷Ⅰ對(duì)人黑素瘤A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響

龍劍文 羅晶 尹緒文 衛(wèi)靜 賀琪 李恒 石全 皮先明

430061武漢，湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院皮膚科［龍劍文（現(xiàn)在湖北省中醫(yī)院皮膚科，430061武漢）］；湖北省中醫(yī)院皮膚科（羅晶、尹緒文、衛(wèi)靜、賀琪、李恒、石全、皮先明）

目的研究重樓皂苷Ⅰ對(duì)人黑素瘤A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。方法采用CCK8法測(cè)定0（對(duì)照組）、1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ對(duì)正常人黑素細(xì)胞和A375細(xì)胞增殖的影響；Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)A375細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡水平；熒光染料（DCFH?DA）測(cè)定A375細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化；羅丹明123染色測(cè)定線粒體膜電位變化；利用分光光度法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ處理后的A375細(xì)胞內(nèi)ATP和上清液中乳酸、葡萄糖含量；Western印跡法檢測(cè)A375細(xì)胞內(nèi)Bcl?2、Bcl?2相關(guān)X蛋白（Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、細(xì)胞周期蛋白D1、丙酮酸激酶同工酶2（PKM2）表達(dá)。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK?q檢驗(yàn)。結(jié)果在工作濃度內(nèi)重樓皂苷Ⅰ對(duì)正常人黑素細(xì)胞增殖無明顯影響，但能明顯抑制A375細(xì)胞的增殖（P＜0.01）；熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ處理后的A375細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。0（對(duì)照組）、1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ分別處理A375細(xì)胞后，隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加，細(xì)胞凋亡率（分別為4.25%±1.27%、10.03%±1.49%、36.62%±1.97%、44.11%±2.47%）逐漸升高（F=665.7，P＜0.01），G0/G1期細(xì)胞比例（分別為54.13% ±2.57%、67.35% ±3.79%、74.39% ±3.29%、82.29%±3.99%）亦漸增多（F=71.81，P＜0.01）；細(xì)胞內(nèi)活性氧呈明顯上升趨勢(shì)，細(xì)胞線粒體膜電位呈明顯下降趨勢(shì)（P＜0.01）；細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降（P＜0.01），培養(yǎng)液中乳酸含量下降，葡萄糖含量上升（P＜ 0.01）；細(xì)胞Bax、cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)增多，但Cyclin D1、Bcl?2和PKM2蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。結(jié)論重樓皂苷Ⅰ可能通過激活細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，引起線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡，并通過抑制PKM2、細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。

黑素瘤；細(xì)胞系，腫瘤；細(xì)胞凋亡；活性氧；細(xì)胞增殖；重樓皂苷Ⅰ

腫瘤細(xì)胞在代謝上表現(xiàn)出較強(qiáng)的糖酵解活性，通過消耗大量葡萄糖并產(chǎn)生乳酸來滿足生長(zhǎng)和增殖的需求，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)［1］。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的重要代謝酶之一，研究表明，丙酮酸激酶同工酶2（PKM2）的高表達(dá)與黑素瘤患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)［2］。重樓是中醫(yī)治療腫瘤的常用藥物之一，其有效成分重樓皂苷Ⅰ對(duì)多種細(xì)胞增殖具有抑制作用［3?5］，但對(duì)黑素瘤細(xì)胞作用如何目前尚不清楚。本研究觀察重樓皂苷Ⅰ對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以及對(duì)Bcl?2、Bcl?2相關(guān)X蛋白（Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved?caspase?3）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、PKM2蛋白表達(dá)的影響。

材料與方法

一、材料

重樓皂苷Ⅰ（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111590?201509）用二甲亞砜（DMSO，沈陽化學(xué)試劑廠）溶解，用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）稀釋，DMSO終體積分?jǐn)?shù)≤0.1%；人黑素瘤A375細(xì)胞（武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；100 U/L青霉素和100 μg/L鏈霉素、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK8（武漢博士德生物公司）；胰蛋白酶、乳酸試劑盒、Hoechst 33258染色劑、Propidium Iodide染色劑、羅丹明123染色劑（美國Sigma公司）；胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、M254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基、人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加成分（HMGS）添加劑（美國Gibco公司）；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠（Annexin?V/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD公司）；活性氧簇（ROS）探針 DCFH?DA（美國Invitrogen公司）；葡萄糖試劑盒、ATP試劑盒（英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的β肌動(dòng)蛋白抗體（上海興悠生物科技有限公司）；PKM2、Cyclin D1、Bax、Bcl?2、cleaved?caspase?3 抗體（美國 Cell signal technology公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（瑞典Amersham Biosciences公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：取A375細(xì)胞，用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）及鏈霉素（100 mg/L）的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞試驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)［6］自健康男性包皮中提取黑素細(xì)胞（經(jīng)湖北省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書），在M254培養(yǎng)基（含HMGS）中培養(yǎng)，鈣離子結(jié)合蛋白S100免疫組化染色證實(shí)純度超過95%。

2.重樓皂苷Ⅰ對(duì)正常黑素細(xì)胞增殖的影響：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正常人黑素細(xì)胞消化后，按5×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，分為只含有培養(yǎng)基和CCK8的空白組以及0（對(duì)照組）、1.5、3.0、6.0、9.0、12.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組，每組6孔，培養(yǎng)48 h后，加入CCK8 10 μl，待培養(yǎng)液顯色后，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A值），以細(xì)胞存活率表示細(xì)胞的增殖程度。細(xì)胞存活率（%）=［（A1-A3）/（A2-A3）］×100%，A1～A3分別為試驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組A值。

3.重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A375細(xì)胞消化后，于96孔板中培養(yǎng)24 h，分為0（對(duì)照組）、1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組，各組培養(yǎng)48 h后，加入CCK8 10 μl，待培養(yǎng)液顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處A值。

4.Hoechst 33258熒光法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化，制備活細(xì)胞懸液，按每孔5×104/L接種于預(yù)先置入玻璃蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液2 ml，培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)分組同方法3，孵育48 h后，吸盡培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，每孔加入4%甲醛溶液固定，PBS洗滌細(xì)胞，Hoechst 33258染色，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A375細(xì)胞，按5×104/L置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加細(xì)胞懸液2 ml，培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)分組同方法3，孵育48 h，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心（半徑10 cm），棄上清液，PBS洗滌，收集細(xì)胞，在冰浴中避光進(jìn)行如下操作：用試劑盒中結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞為5× 104/L，加入Annexin?FITC和PI染色液，混勻后孵育15 min，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞包括早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞。

6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)A375細(xì)胞周期變化：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5.0×104/L，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)分組同方法3，培養(yǎng)48 h，消化，1 000 r/min離心（半徑10 cm），棄上清液，預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，離心洗滌3次，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇4℃固定過夜。測(cè)定前用PBS洗去乙醇，加入含有核糖核酸酶RNase的0.05%PI染色液，避光染色30 min后，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量的變化。

7.重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位水平的影響［7］：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A375細(xì)胞，按5×104/L置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加細(xì)胞懸液2 ml，培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)分組同方法3，孵育48 h，收集細(xì)胞，洗滌，消化，收集，重懸細(xì)胞，各組部分細(xì)胞加入ROS探針 DCFH?DA 10 μmol/L，孵育60 min，PBS洗滌3次，消化后收集細(xì)胞，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，進(jìn)而測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化。部分細(xì)胞加入羅丹明123 1 mmol/L，孵育30 min，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，觀察線粒體膜電位變化。

8.重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞ATP含量及培養(yǎng)上清液乳酸和葡萄糖含量的影響：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，按2×105/L置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加細(xì)胞懸液2 ml，培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)分組同方法3，孵育48 h。收集細(xì)胞，根據(jù)ATP測(cè)試盒說明書測(cè)定ATP含量；收集上清液，根據(jù)乳酸和葡萄糖測(cè)試盒說明書測(cè)定上清液乳酸和葡萄糖含量。

9.Western 印跡法檢測(cè) A375細(xì)胞 Bax、Bcl?2、cleaved?caspase?3、Cyclin D1、PKM2蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A375細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)分組同方法3，孵育48 h，收集細(xì)胞，提取總蛋白，用二喹啉甲酸法蛋白定量，上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉l h；PBS洗膜后加入一抗，4℃過夜；PBS洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育0.5 h；洗膜，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)。結(jié)果掃描后，用Quantity one圖像分析軟件分析，用各目的蛋白灰度值與β肌動(dòng)蛋白灰度值的比值代表各檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以±s表示，若符合正態(tài)分布及方差齊性，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、重樓皂苷Ⅰ對(duì)正常黑素細(xì)胞增殖的影響

對(duì)照組黑素細(xì)胞存活率為99.22%±1.83%，1.5、3.0、6.0、9.0、12.0 mg/L 重樓皂苷Ⅰ組分別為97.36%±2.56%、97.19%±1.23%、97.02%±1.40%、89.86%±2.58%、80.86%±2.66%，6組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.98，P＜ 0.01）；1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為1.14、1.29、1.43，均P＞0.05），9.0、12.0mg/L重樓皂苷Ⅰ組低于對(duì)照組（q值分別為7.44、15.00，P＜0.05）。因此以下試驗(yàn)選定重樓皂苷Ⅰ的工作濃度為1.5、3.0、6.0 mg/L。

二、重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響

0（對(duì)照組）與1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組A375細(xì)胞存活率（表1）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.73，P＜0.01），細(xì)胞存活率隨重樓皂苷Ⅰ濃度的增加而降低，相鄰兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為8.51、7.53、4.48，P＜ 0.05）。

三、重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞凋亡率的影響

經(jīng)Hoechst染色，對(duì)照組A375細(xì)胞大而飽滿，呈均勻藍(lán)色熒光。重樓皂苷Ⅰ處理組細(xì)胞核可見濃染致密的顆粒熒光，細(xì)胞縮?。浑S重樓皂苷Ⅰ濃度增加，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，高倍鏡下可觀察到細(xì)胞變小，胞核皺縮、碎裂，染色質(zhì)濃縮，聚集在核膜邊緣，形成染色質(zhì)邊集。見圖1。

AnnexinV/PI雙染法結(jié)果顯示，0（對(duì)照組）與1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組A375細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=665.7，P＜0.01），細(xì)胞凋亡率隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加而升高，相鄰兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為 7.62、35.06、9.87，P＜0.05）。見圖2，表1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察重樓皂苷Ⅰ處理后各組A375細(xì)胞凋亡形態(tài)變化（Hoechst 33258染色×200） 1A～1D：分別為0、1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組。隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，高倍鏡下可觀察到細(xì)胞變小，胞核皺縮、碎裂，染色質(zhì)濃縮，聚集在核膜邊緣，形成染色質(zhì)邊集

圖2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞凋亡率的影響 2A～2D：分別為0、1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組；Q1代表壞死細(xì)胞，Q2代表晚期凋亡細(xì)胞，Q3代表正常細(xì)胞，Q4代表早期凋亡細(xì)胞

表1 不同濃度重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞的影響（±s）

表1 不同濃度重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞的影響（±s）

注：n=6

線粒體膜電位下降細(xì)胞比例（%）5.41±1.08 11.84±1.93 17.17±1.32 46.77±3.45 432.70＜0.01重樓皂苷Ⅰ（mg/L）0 1.5 3.0 6.0 F值P值存活率（%）95.60±9.00 69.11±5.72 59.64±8.33 45.67±7.05 45.73＜0.01凋亡率（%）4.25±1.27 10.03±1.49 36.62±1.97 44.11±2.47 665.7＜0.01 G0/G1期細(xì)胞比例（%）54.13±2.57 67.35±3.79 74.39±3.29 82.29±3.99 71.81＜0.01總活性氧1.03±0.09 1.25±0.06 1.81±0.11 2.61±0.17 219.87＜0.01 ATP（μmol/g·protien）31.64±2.64 24.33±2.05 17.04±1.61 13.38±2.15 85.78＜0.01上清液乳酸（mmol/L）7.59±0.88 5.35±0.88 4.11±0.93 2.94±0.89 29.81＜0.01上清液葡萄糖（mmol/L）3.65±0.38 4.52±0.37 5.60±0.41 6.98±0.47 11.45＜0.01

四、重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞周期變化的影響

0（對(duì)照組）與1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組A375細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例（表1）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=71.81，P＜0.01），且隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加而升高，相鄰兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為9.38、4.99、5.60，P＜ 0.05）。見表1。

五、重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞線粒體膜電位的影響

0（對(duì)照組）與1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組A375細(xì)胞線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例（表1）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=432.70，P＜0.01），且隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加而升高，相鄰兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為7.32、6.06、33.66，P＜ 0.05）。見表1。

六、重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞ROS、ATP、培養(yǎng)上清液乳酸及葡萄糖含量的影響

0（對(duì)照組）與1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組A375細(xì)胞ROS、ATP、上清液乳酸及葡萄糖含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），且隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加，細(xì)胞內(nèi)活性氧呈明顯上升趨勢(shì)，ATP含量下降（P＜0.01），培養(yǎng)液中乳酸含量下降，葡萄糖含量上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。見表1。

七、重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

0（對(duì)照組）與1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組A375細(xì)胞Bcl?2、Bax、cleaved caspase?3表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2），且隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加，Bcl?2蛋白表達(dá)下降，而細(xì)胞Bax、cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)增多，相鄰兩組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。見圖3、表2。

八、重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞Cyclin D1、PKM2蛋白表達(dá)的影響

0（對(duì)照組）與1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ組A375細(xì)胞Cyclin D1、PKM2蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且隨重樓皂苷Ⅰ濃度增加，Cyclin D1和PKM2蛋白表達(dá)下降。見表2、圖4。

圖3 Western印跡法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 1～4：0、1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ處理組；cleaved?caspase?3：活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

圖4 重樓皂苷Ⅰ對(duì)A375細(xì)胞肌肉丙酮酸激酶同工酶2（PKM2）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）表達(dá)的影響 1～4：分別為對(duì)照組和1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ處理組

表2 不同濃度重樓皂苷Ⅰ處理A375細(xì)胞Bcl?2、Bax、cleaved?caspase?3、周期蛋白D1、PKM2的表達(dá)（±s）

表2 不同濃度重樓皂苷Ⅰ處理A375細(xì)胞Bcl?2、Bax、cleaved?caspase?3、周期蛋白D1、PKM2的表達(dá)（±s）

注：n=3。經(jīng)SNK?q檢驗(yàn)，各檢測(cè)指標(biāo)相鄰兩組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。cleaved?caspase?3，活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；PKM2，丙酮酸激酶同工酶2

0 1.5 3.0 6.0 F值P值1.05±0.12 0.52±0.12 0.25±0.10 0.15±0.05 91.11＜0.01 1.02±0.14 1.54±0.16 2.26±0.16 3.13±0.24 152.80＜0.01 1.02±0.16 1.52±0.15 3.97±0.22 5.93±0.31 654.90＜0.01 1.02±0.09 0.82±0.05 0.55±0.06 0.31±0.06 117.14＜0.01 3.13±0.24 2.26±0.16 1.54±0.16 1.02±0.14 152.80＜0.01

討 論

藥理研究顯示，重樓具有抗腫瘤生物學(xué)活性，活性成分主要是甾體皂苷類，重樓皂苷Ⅰ是其重要成分之一［8］。有研究表明，重樓皂苷Ⅰ對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用，但對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞和氣管上皮細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用［9］。

本研究表明，1.5、3.0、6.0 mg/L重樓皂苷Ⅰ對(duì)正常人黑素細(xì)胞增殖無影響，而A375細(xì)胞增殖能力隨重樓皂苷Ⅰ濃度升高而逐漸降低，提示重樓皂苷Ⅰ具有抑制A375細(xì)胞增殖的活性。細(xì)胞增殖調(diào)控存在兩個(gè)重要調(diào)控點(diǎn)即G1/S期和G2/M期，當(dāng)正向調(diào)節(jié)因子積累到越過G1/S期臨界點(diǎn)的濃度水平，細(xì)胞就會(huì)按照一定的順序完成整個(gè)周期，所以G1/S期是細(xì)胞周期的重要節(jié)點(diǎn)［10］。Cyclin D1是G1/S調(diào)控點(diǎn)的關(guān)鍵因子之一［11］。PKM2作為糖酵解酶主要定位于細(xì)胞質(zhì)，還可以單體形式遷移入細(xì)胞核與β連環(huán)蛋白結(jié)合，促進(jìn)組蛋白去乙酰化酶3從Cyclin D1基因啟動(dòng)子解離，促進(jìn)Cyclin D1表達(dá)，進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程［12］。我們研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ處理后A375細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多，細(xì)胞阻滯于G1期，凋亡率明顯上升，提示重樓皂苷Ⅰ能夠調(diào)控細(xì)胞周期；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ處理后A375細(xì)胞PKM2、Cyclin D1的表達(dá)明顯下降，提示重樓皂苷Ⅰ可能通過下調(diào)PKM2蛋白的表達(dá)，抑制Cyclin D1的表達(dá)，從而使細(xì)胞在G1期被阻滯。糖酵解是葡萄糖在酶的催化下降解成丙酮酸，在缺氧條件下進(jìn)一步被還原為乳酸，并生成ATP的過程；腫瘤細(xì)胞需依賴糖酵解產(chǎn)生ATP來進(jìn)行增殖，因此抑制糖酵解就會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平和培養(yǎng)液中乳酸含量［13］，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。重樓皂苷Ⅰ作用于A375細(xì)胞后，PKM2表達(dá)明顯下降，細(xì)胞內(nèi)ATP含量和培養(yǎng)液中乳酸含量減少，且上清液中葡萄糖含量增加，進(jìn)一步提示重樓皂苷Ⅰ可以通過下調(diào)PKM2蛋白表達(dá)，抑制A375細(xì)胞糖酵解途徑，從而抑制細(xì)胞增殖。此外，重樓皂苷Ⅰ還可以誘導(dǎo)胞質(zhì)ROS升高，過量的ROS可以損傷線粒體，造成線粒體氧化還原狀態(tài)失衡，引起線粒體凋亡通路活化，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14］。試驗(yàn)證實(shí)，重樓皂苷Ⅰ作用A375細(xì)胞后可使凋亡相關(guān)蛋白Bcl?2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，caspase?3活化，說明重樓皂苷Ⅰ處理可以誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。同時(shí)，需要指出的是由于條件所限，本研究中缺少陽性對(duì)照藥，以及與公認(rèn)抗黑素瘤藥物協(xié)同效應(yīng)的測(cè)評(píng)，相關(guān)結(jié)果尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們證實(shí)重樓皂苷Ⅰ能夠通過抑制PKM2蛋白，下調(diào)Cyclin D1表達(dá)，使細(xì)胞周期停留在G1期，并抑制A375細(xì)胞糖酵解途徑；誘導(dǎo)胞質(zhì)ROS升高，降低線粒體膜電位；調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為中藥重樓治療黑素瘤提供了一定的依據(jù)。

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Effects of polyphyllinⅠon the proliferation and apoptosis of human melanoma cell line A375

Long Jianwen,Luo Jing,Yin Xuwen,Wei Jing,He Qi,Li Heng,Shi Quan,Pi Xianming
Department of Dermatology,The First Clinical Medical School of Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430061,China（Long JW［current affiliation:Department of Dermatology,Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China］）;Department of Dermatology,Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China（Luo J,Yin XW,Wei J,He Q,Li H,Shi Q,Pi XM）

Long Jianwen,Email:ljwhbzyy@qq.com

ObjectiveTo investigate effects of polyphylinⅠon the proliferation and apoptosis of human melanoma cell line A375,and to explore their mechanisms.MethodsNormal human melanocytes isolated from healthy human foreskin were divided into 6 groups to be treated with 0,1.5,3.0,6.0,9.0,12.0 mg/L polyphyllinⅠrespectively.A375 melanoma cells were divided into 4 groups,i.e.,control group,1.5?,3.0?,6.0?mg/L polyphyllinⅠ groups,to be treated with 0,1.5,3.0,6.0 mg/L polyphyllinⅠ,respectively.Cell counting kit?8（CCK8）assay was performed to evaluate the effect of polyphyllinⅠ on the proliferation of normal human melanocytes and A375 cells.Hoechst 33258 fluorescent staining was conducted to observe the morphology of apoptotic cells,flow cytometry to estimate cell cycle phase distribution and apoptosis rate,dichloro?dihydro?fluorescein diacetate（DCFH?DA）fluorescent probe assay to detect the level of reactive oxygen species（ROS）,rhodamine ?123 staining to evaluate changes of mitochondrial membrane potential,spectrophotography to detect the level of ATP in A375 cells,as well as levels of lactic acid and glucose in the culture supernatant of A375 cells,and Western blot analysis to determine the protein expression of Bcl?2,Bcl?2?related X protein（Bax）,cleaved?caspase?3,cyclin D1 and pyruvate kinase isozyme type M2（PKM2）.Statistical analysis was carried out by using one?way analysis of variance（ANOVA）for comparisons among groups and Student?Newman?Keuls?q（SNK?q）test for multiple comparisons.ResultsCCK8 assay showed that the treatment with polyphyllinⅠat concentrations of 1.5,3.0,6.0 mg/L for 48 hours had no effects on the proliferation of normal human melanocytes,but significantly inhibited the proliferation of A375 cells.The survival rate of A375 cells was significantly lower in the 1.5?,3.0?,6.0?mg/L polyphyllinⅠgroups than in the control group（P＜ 0.01）.After the treatment with polyphyllinⅠ,distinct apoptotic morphology of A375 cells was observed under fluorescence microscope.Additionally,along with the increase of polyphyllinⅠconcentrations（0,1.5,3.0,6.0 mg/L）,there were gradual increasing trends in the apoptosis rate of A375 cells（4.25% ±1.27%,10.03% ±1.49%,36.62% ±1.97%,44.11%±2.47%respectively,F=665.7,P＜ 0.01）,the percentage of A375 cells at G0/G1 phase（54.13% ± 2.57%,67.35%±3.79%,74.39%±3.29%,82.29%±3.99%respectively,F=71.81,P＜0.01）,the level of ROS in A375 cells（P＜ 0.01）,the level of glucose in the culture supernatant（P＜ 0.01）,and the protein expression of Bax and cleaved?caspase?3（bothP＜ 0.01）,while gradual decreasing trends were found in the levels of mitochondrialmembranepotential and ATPinA375cells（bothP＜ 0.01）,thelevel of lacticacidintheculture supernatant（P＜ 0.01）,and the protein expression of Cyclin D1,Bcl?2 and PKM2（allP＜ 0.01）.ConclusionPolyphyllinⅠcan effectively induce A375 cell apoptosis by promoting the production of ROS in A375 cells and decreasing the mitochondrial membrane potential,and arrest A375 cells at G0/G1 phase by inhibiting the expression of PKM2 and Cyclin D1.

Melanoma;Cell line,tumor;Apoptosis;Reactive oxygen species;Cell proliferation;PolyphyllinⅠ

Fund program:Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Research Project of Health and Family Planning Commission of Hubei Province（2013Z?B05）

龍劍文，Email：ljwhbzyy@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.006

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委中西醫(yī)結(jié)合科研計(jì)劃項(xiàng)目（2013Z?B05）

2016?11?04）

朱思維 顏艷）