賈肖肖 胡文婷 王敏 華優(yōu) 高亞麗 耿清偉 李劉雨 宋秀祖

310009杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院 杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

·論著·

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚黑素小體轉(zhuǎn)移與降解的影響

賈肖肖 胡文婷 王敏 華優(yōu) 高亞麗 耿清偉 李劉雨 宋秀祖

310009杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院 杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

目的觀察茶多酚單體表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)小鼠皮膚色素沉著及黑素小體轉(zhuǎn)移和降解的影響，探討自噬在其中的作用機(jī)制。方法將16只C57/BL6雌性小鼠32只鼠耳用簡(jiǎn)單隨機(jī)方法隨機(jī)等分為4組：①丙酮對(duì)照組：每日予丙酮溶液外涂耳部皮膚；②EGCG組：每日予10 g/L EGCG丙酮溶液外涂；③UVB照射組：?jiǎn)未?00 mJ/cm2UVB照射，照射2 h后每日外涂丙酮溶液；④UVB+EGCG組：?jiǎn)未蜺VB照射2 h后每日外涂EGCG丙酮溶液。10 d后處死小鼠，收集耳部皮膚，透射電鏡觀察黑素小體及自噬體超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組化法檢測(cè)蛋白酶活性受體2（PAR2）及微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）在表皮中的表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)PAR2、Rab27a及LC3在表皮中的表達(dá)。結(jié)果丙酮對(duì)照組、UVB照射組、UVB+EGCG組和EGCG組間黑素小體及自噬體數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H值分別為12.249、13.888，均P＜0.05）；與丙酮對(duì)照組小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)黑素小體數(shù)量（1.00±0.41）、自噬體數(shù)量（1.00±0.46）相比，UVB照射組黑素小體（1.85±0.32）和自噬體（1.94±0.64）均顯著增加（均P＜0.05）；相較于UVB照射組，UVB+EGCG組黑素小體（1.30±0.44）顯著減少（P＜0.05），而自噬體（3.03±0.75）則明顯增加（P＜0.05）。免疫組化顯示，4組間PAR2在表皮中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=18.700，P＜0.05）；與UVB照射組（12.54±3.07）比較，UVB+EGCG組PAR2表達(dá)（7.94±4.57）顯著減少（Z=2.143，P＜0.05）；但4組表皮LC3表達(dá)均不明顯，表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=5.051，P＞0.05）。免疫印跡顯示，4組間PAR2、Rab27a表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為18.739、25.967、24.022，均P＜0.05）；與UVB照射組（PAR2 3.12±0.61，Rab27a 1.42±0.07，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ1.24±0.07）比較，UVB+EGCG組PAR2（0.91±0.54）、Rab27a（0.99±0.16）表達(dá)均顯著減少（P＜ 0.05），而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（1.67± 0.08）則顯著增加（P＜0.05）。結(jié)論外用EGCG能有效抑制UVB誘導(dǎo)的皮膚色素沉著，其作用機(jī)制可能與抑制黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)及促進(jìn)黑素小體自噬有關(guān)。

多酚類(lèi)；紫外線；自噬；黑素類(lèi)；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯

黑素代謝包括黑素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解。目前對(duì)于色素沉著機(jī)制研究大多集中在黑素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)黑素降解的研究較少。黑素降解是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，細(xì)胞自噬是其可能的降解機(jī)制［1?2］，研究黑素的降解機(jī)制有助于探索新的治療方向。我們采用中波紫外線（UVB）照射小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生皮膚色素沉著模型，并外用茶多酚單體表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）處理，觀察黑素轉(zhuǎn)運(yùn)和降解變化，探討自噬在黑素降解中的作用機(jī)制，為茶多酚外用治療黃褐斑等色素沉著性皮膚病提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

16只健康SPF級(jí)6～8周齡C57/BL6雌鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)2008001655143，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)［SYXK（浙）2013?0184］，體重（16.3 ± 0.87）g，于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境下飼養(yǎng)。紫外線光療儀SS?04B、UVB輻照度監(jiān)視器來(lái)自上海希格瑪高科技有限公司，光源使用德國(guó)飛利浦公司寬波UVB紫外線低壓燈管。EGCG（美國(guó)Sigma公司），25%戊二醛溶液（美國(guó)Sigma?Aldrich公司），鼠抗Rab27a單克隆抗體、鼠抗蛋白酶活性受體2（PAR2）單克隆抗體及兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）多克隆抗體均來(lái)自美國(guó)Abcam公司。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將16只C57/BL6雌性小鼠32只鼠耳用簡(jiǎn)單隨機(jī)化方法隨機(jī)分為4組，每組8只鼠耳，①丙酮對(duì)照組：每日予以丙酮溶液外涂耳部皮膚；②EGCG組：每日予以10 g/L EGCG丙酮溶液外涂耳部皮膚；③UVB照射組：?jiǎn)未握丈銾VB，劑量500 mJ/cm2，照射2 h后每日外涂丙酮溶液；④UVB+EGCG組：?jiǎn)未?00 mJ/cm2UVB照射2 h后，每日外涂EGCG丙酮溶液。如一只小鼠的兩只耳朵被分到非照射組和照射組，對(duì)非照射組耳朵則予以紙板遮擋。10 d后處死小鼠，收集耳部皮膚進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

三、透射電鏡觀察黑素小體及自噬體變化

常規(guī)取小鼠耳部皮膚，置于預(yù)冷2.5%戊二醛固定液中，1%鋨酸溶液固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，丙酮浸透，包埋，聚合，超薄切片并染色。透射電鏡下觀察，拍照，每組選8個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

四、免疫組化檢測(cè)PAR2及LC3表達(dá)

小鼠耳部皮膚常規(guī)處理，石蠟包埋、切片、脫蠟，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育，加熱修復(fù)抗原，封閉液封閉。加入一抗鼠抗PAR2單克隆抗體及兔抗LC3多克隆抗體，4℃濕盒孵育過(guò)夜。用PBS浸洗3次，每次5 min，繼之滴加二抗羊抗鼠或羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶（HRP），PBS浸洗3次，3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，封片。顯微鏡下觀察，每張玻片采用簡(jiǎn)單隨機(jī)方法隨機(jī)選3個(gè)視野拍照，圖像分析系統(tǒng)測(cè)定吸光度（A值），取均值作為蛋白表達(dá)水平。

五、免疫印跡檢測(cè)PAR2、Rab27a及自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)

分離各組小鼠表皮組織，剪碎，液氮冷凍研磨，裂解液裂解，提取蛋白并進(jìn)行定量。每孔加入相同量總蛋白30 μg進(jìn)行垂直凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫包被1 h。繼之分別加入鼠抗PAR2、Rab27a單克隆抗體及兔抗LC3多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST溶液洗膜3次，每次15 min。再加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜3次?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的條帶并分析條帶灰度值，以目的蛋白/β肌動(dòng)蛋白灰度比值代表蛋白表達(dá)水平，并設(shè)定丙酮對(duì)照組為1進(jìn)行分析。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間PAR2、Rab27a與LC3的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果通過(guò)單因素方差分析比較，并用SNK法進(jìn)行兩兩比較。黑素小體及自噬體數(shù)量、PAR2與LC3的免疫組化檢測(cè)結(jié)果用Kruskal?WallisH檢驗(yàn)，并用Mann?Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、UVB及EGCG處理后小鼠皮膚黑素小體變化

UVB照射組小鼠照光后第3天耳部皮膚開(kāi)始出現(xiàn)明顯充血、紅斑、輕微脫屑及色素沉著，第10天出現(xiàn)明顯色素沉著，與UVB+EGCG組相比，肉眼觀察皮膚顏色未見(jiàn)顯著差異。見(jiàn)圖1。

透射電鏡觀察顯示，每組小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞及黑素細(xì)胞中均可見(jiàn)清晰的黑素小體結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為致密深黑色圓形或橢圓形顆粒樣結(jié)構(gòu)，著色程度不同，散在或成簇分布在細(xì)胞質(zhì)中。4組間黑素小體數(shù)量（表1）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與丙酮對(duì)照組相比，EGCG組小鼠皮膚黑素小體未見(jiàn)顯著變化（Z=0.081，P＞0.05），UVB照射組顯著增加（Z=2.802，P＜0.05）；與UVB照射組比較，UVB+EGCG組黑素小體明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.887，P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

圖1 各組小鼠耳部皮膚情況 丙酮對(duì)照組肉眼觀察實(shí)驗(yàn)前后耳部皮膚無(wú)明顯變化；EGCG組實(shí)驗(yàn)前后耳部皮膚無(wú)明顯變化，實(shí)驗(yàn)第10天與丙酮對(duì)照組相比，亦無(wú)明顯差異；UVB照射組實(shí)驗(yàn)（照光后）第3天皮膚開(kāi)始出現(xiàn)色素沉著，第10天更加顯著；UVB+EGCG組實(shí)驗(yàn)（照光后）第10天與UVB照射組相比，皮膚色素沉著程度無(wú)明顯差異。EGCG：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；UVB：中波紫外線

表1 中波紫外線（UVB）與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子兒酸酯（EGCG）處理后小鼠皮膚黑素小體、自噬體數(shù)量以及蛋白酶活性受體2（PAR2）與抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）等的表達(dá)（±s）

表1 中波紫外線（UVB）與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子兒酸酯（EGCG）處理后小鼠皮膚黑素小體、自噬體數(shù)量以及蛋白酶活性受體2（PAR2）與抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）等的表達(dá)（±s）

注：n=8。a與丙酮對(duì)照組相比，P ＜0.05；b與UVB照射組相比，P＜0.05；cH值；dF值

組別丙酮對(duì)照組UVB照射組UVB+EGCG組EGCG組F/H值P值黑素小體（個(gè)/視野）1.00±0.41 1.85±0.32a 1.30±0.44b 0.99±0.32 12.249c＜0.05自噬體（個(gè)/視野）1.00±0.46 1.94±0.64a 3.03±0.75b 1.15±0.25 13.888c＜0.05免疫組化（A值）PAR2 1.00±1.31 12.54±3.07a 7.94±4.57b 0.67±0.21 18.700c＜0.05 LC3 1.00±0.02 1.28±0.13 1.54±0.41 1.08±0.42 5.051c＞0.05免疫印跡PAR2 1.00±0.35 3.12±0.61a 0.91±0.54b 0.44±0.33 18.739d＜0.05 Rab27a 1.00±0.15 1.42±0.07a 0.99±0.16b 0.39±0.17 25.967d＜0.05 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ1.00±0.07 1.24±0.07a 1.67±0.08b 1.26±0.28 24.022d＜0.05

二、UVB與EGCG處理后小鼠皮膚自噬體變化

透射電鏡觀察顯示，丙酮對(duì)照組小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)自噬溶酶體及溶酶體內(nèi)的黑素小體集合體結(jié)構(gòu)（圖3）。4組間自噬溶酶體數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。與丙酮對(duì)照組相比，EGCG組小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中自噬溶酶體增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；UVB照射組明顯增加，約為丙酮對(duì)照組的1.94倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.102，P＜0.05），但黑素小體集合體未見(jiàn)增多。與UVB照射組比較，UVB+EGCG組小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中自噬溶酶體增加更為顯著，約為丙酮對(duì)照組的3.03倍，且溶酶體內(nèi)黑素小體集合體多見(jiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.991，P＜0.05）。

三、PAR2與LC3免疫組化檢查結(jié)果

UVB照射組小鼠表皮呈反應(yīng)性增生，UVB+EGCG組小鼠表皮亦明顯增厚。免疫組化結(jié)果顯示，4組小鼠表皮PAR2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丙酮對(duì)照組與EGCG組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.816，P＞0.05）；而UVB照射組表達(dá)顯著增加，約為丙酮對(duì)照組的12.54倍（Z=3.240，P＜0.05），亦顯著高于UVB+EGCG組（Z=2.143，P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖4。

4組LC3在表皮表達(dá)不明顯，各組之間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

四、PAR2、Rab27a與LC3免疫印跡檢查結(jié)果

4組小鼠表皮PAR2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），UVB照射組約為丙酮對(duì)照組的3.12倍（q=5.148，P＜0.05），亦顯著高于UVB+EGCG組（q=4.642，P＜ 0.05）。見(jiàn)表1、圖5。

4組小鼠表皮Rab27a表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），UVB照射組約為丙酮對(duì)照組的1.42倍（q=4.483，P＜0.05），亦顯著高于UVB+EGCG組（q=4.263，P＜ 0.05）。見(jiàn)表1、圖5。

4組小鼠表皮LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），UVB照射組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值約為丙酮對(duì)照組的1.24倍（q=4.072，P＜0.05），但低于UVB+EGCG組（q=6.959，P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖5。

圖2 透射電鏡觀察中波紫外線（UVB）與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）處理后小鼠皮膚黑素小體（紅色箭頭）的變化 2A：丙酮對(duì)照組，細(xì)胞核旁可見(jiàn)少量黑素小體，散在分布；2B：UVB組，黑素小體明顯增多；2C：UVB+EGCG組，與UVB組相比黑素小體減少；2D：EGCG組，少量黑素小體分布于核周，數(shù)量與丙酮對(duì)照組無(wú)明顯差異

圖3 透射電鏡觀察中波紫外線（UVB）與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）處理后小鼠皮膚自噬體的變化 3A：丙酮對(duì)照組，可見(jiàn)膜結(jié)構(gòu)狀自噬溶酶體及溶酶體內(nèi)黑素小體集合體；3B：UVB組，自噬溶酶體明顯增多，并見(jiàn)少量溶酶體內(nèi)黑素小體集合體；3C：UVB+EGCG組，自噬溶酶體明顯增加，且溶酶體內(nèi)黑素小體集合體多見(jiàn)；3D：EGCG組，與對(duì)照組相比自噬體稍增多，可見(jiàn)少量溶酶體內(nèi)黑素小體集合體。紅色箭頭示自噬溶酶體，藍(lán)色箭頭示溶酶體內(nèi)黑素小體集合體

圖4 各組小鼠耳部皮膚蛋白酶活性受體2（PAR2）的表達(dá)變化（免疫組化×200） 4A：丙酮對(duì)照組，表皮無(wú)明顯變化，PAR2少量表達(dá)；4B：UVB組，表皮明顯增厚，PAR2表達(dá)增加；4C：UVB+EGCG組，表皮明顯增厚，與UVB組相比，PAR2表達(dá)減少；4D：EGCG組，表皮無(wú)明顯變化

圖5 免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白酶活性受體2（PAR2）、Rab27a與微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）的表達(dá)變化 1：丙酮對(duì)照組；2：中波紫外線（UVB）照射組；3：UVB+表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）組；4：EGCG組

討 論

黃褐斑是臨床常見(jiàn)的色素增加性皮膚病，病理表現(xiàn)為表皮全層黑素顆粒增加，與黑素代謝異常有關(guān)［3］。在黑素代謝過(guò)程中，黑素小體在黑素細(xì)胞中合成后轉(zhuǎn)移入角質(zhì)形成細(xì)胞并重新分布和降解，隨角質(zhì)形成細(xì)胞不斷分化逐層上移，最后隨角質(zhì)層脫落而排出［4］。黑素小體轉(zhuǎn)移至角質(zhì)形成細(xì)胞并在其中降解的過(guò)程，對(duì)皮膚的色素代謝至關(guān)重要，其功能紊亂可導(dǎo)致皮膚色素沉著。

UVB照射可以促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、黑素合成增加，也可以促進(jìn)黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)增加［5］。Rab27a是一種組織特異性蛋白，Kukimoto?Niino等［6］研究發(fā)現(xiàn)，Rab27a可與其特異效應(yīng)分子Slac2?a結(jié)合，定位到成熟黑素小體表面，介導(dǎo)黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)。PAR2位于角質(zhì)形成細(xì)胞膜表面，是跨膜G蛋白耦聯(lián)受體，可被絲氨酸蛋白酶剪切而活化，進(jìn)一步介導(dǎo)黑素小體轉(zhuǎn)移［7］。本研究顯示，UVB照射后，小鼠皮膚黑素小體顯著增加，轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)ab27a及PAR2表達(dá)明顯增多，表明UVB照射可以促進(jìn)黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)，其機(jī)制可能與促進(jìn)Rab27a及PAR2表達(dá)增加有關(guān)。既往研究證實(shí)，EGCG能夠抑制黑素細(xì)胞小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）轉(zhuǎn)錄活性，抑制酪氨酸酶活性和蛋白表達(dá)，從而抑制黑素合成［8］。本研究中我們采用EGCG丙酮溶液外涂小鼠皮膚，結(jié)果顯示，EGCG可以抑制UVB照射誘導(dǎo)的Rab27a及PAR2表達(dá)，從而抑制黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)移；電鏡下發(fā)現(xiàn)，EGCG處理后小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中黑素小體顯著減少，表明EGCG可以通過(guò)抑制黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)移發(fā)揮美白作用。

黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)至角質(zhì)形成細(xì)胞后進(jìn)行再分布與降解，其降解機(jī)制與細(xì)胞自噬相關(guān)。Murase等［1］研究發(fā)現(xiàn)，白種人角質(zhì)形成細(xì)胞自噬活性比黑種人高，自噬可能通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞中黑素小體的降解而使皮膚顏色變白。進(jìn)一步采用特異性siRNA抑制自噬相關(guān)基因ATG7表達(dá)可以顯著增加黑素小體PMEL17的表達(dá)，同時(shí)伴有自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ蛋白表達(dá)減少，表明抑制自噬可以減少黑素小體降解。Kim等［9］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬反應(yīng)，可以顯著抑制α促黑素細(xì)胞激素（α?MSH）引起的皮膚色素沉著。這些研究均證實(shí)，細(xì)胞自噬參與角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)黑素小體降解。既往研究已經(jīng)證實(shí)，UVB照射可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的自噬活性［10?11］，而EGCG也可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬活性，減少脂質(zhì)沉積［12］。電鏡下自噬溶酶體是溶酶體單層膜空泡樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)含吞噬的細(xì)胞器碎片；自噬體是經(jīng)典的雙層膜結(jié)構(gòu)；部分溶酶體內(nèi)可見(jiàn)黑素小體集合體，認(rèn)為是溶酶體包裹多個(gè)黑素小體形成的結(jié)構(gòu)。由于自噬是動(dòng)態(tài)的自噬流，因此電鏡可能難以捕捉到，本研究電鏡可能觀察到的是自噬溶酶體。本研究電鏡結(jié)果顯示，UVB照射后小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞自噬泡及自噬溶酶體明顯增加，但溶酶體內(nèi)未見(jiàn)黑素小體集合體；EGCG處理后角質(zhì)形成細(xì)胞中自噬泡及自噬溶酶體進(jìn)一步增加，可能提示黑素小體降解增多。既往研究認(rèn)為，黑素小體集合體是溶酶體包裹的黑素小體，通常在淺色皮膚中較易發(fā)現(xiàn)；黑素小體被溶酶體包裹后更易降解，從而導(dǎo)致皮膚顏色變淡［13?15］。黑素小體集合體可以是黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移而來(lái)，也可以是角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)溶酶體吞噬形成，本研究中未用免疫電鏡標(biāo)記，尚不能精確區(qū)分，但仍提示EGCG可能促進(jìn)溶酶體吞噬黑素小體，加速黑素小體降解。本研究免疫組化結(jié)果未提示EGCG處理后表皮LC3表達(dá)增加，推測(cè)原因可能是表皮總LC3生成沒(méi)有顯著增加。但免疫印跡發(fā)現(xiàn)，EGCG處理后，UVB+EGCG組較UVB組小鼠表皮LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著增加，推測(cè)其原因可能是EGCG通過(guò)增加LC3Ⅱ表達(dá)促進(jìn)自噬發(fā)生。另外，EGCG也可以通過(guò)其他途徑促進(jìn)自噬，如AKT/STAT3途徑等［16］。我們?cè)诮窈笱芯恐袑⑦M(jìn)一步探討EGCG的其他促自噬機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠有效抑制UVB誘導(dǎo)皮膚色素沉著，作用機(jī)制可能與抑制黑素轉(zhuǎn)運(yùn)及促進(jìn)黑素降解有關(guān)。EGCG抑制黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制可能與抑制轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)ab27a及PAR2表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)黑素降解的機(jī)制可能與促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和增加細(xì)胞自噬有關(guān)。提示可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬誘導(dǎo)黑素小體降解。

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Effect of epigallocatechin gallate on ultraviolet B?induced transfer and degradation of melanosomes in mice

Jia Xiaoxiao,Hu Wenting,Wang Min,Hua You,Gao Yali,Geng Qingwei,Li Liuyu,Song Xiuzu
Department of Dermatology,Hangzhou Third Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310009,China

Song Xiuzu,Email:songxiuzu@sina.com

ObjectiveTo evaluate the effect of tea polyphenol epigallocatechin gallate（EGCG）on ultraviolet B（UVB）?induced skin pigmentation,transfer and degradation of melanosomes in mice,and to explore the role of autophagy in the mechanism of melanosome degradation.MethodsA total of 32 ears from 16 female C57/BL6 mice were randomly and equally divided into 4 groups:acetone control group topically treated with acetone solution daily,EGCG group topically treated with 10 g/L EGCG acetone solution daily,UVB irradiation group irradiated with 500 mJ/cm2UVB once a day and 2 hours later topically treated with acetone solution,UVB+EGCG group irradiated with 500 mJ/cm2UVB once a day and 2 hours later topically treated with EGCG acetone solution.Ten days later,all the mice were sacrificed,and skin tissue samples were collected from the ears.Transmission electron microscopy was performed to observe ultrastructural changes of melanosomes and autophagosomes,immunohistochemical study to measure expression of protease?activated receptor 2（PAR2）and microtubule?associated protein light chain 3（LC3）in the epidermis,and Western blot analysis to determine the protein expression of PAR2,Ras?related protein Rab27a and LC3 in the epidermis.ResultsThere was a significant difference in the number of melanosomes and autophagosomes among the acetone control group,EGCG group,UVB irradiation group and UVB+EGCG group（H=12.249,13.888,respectively,bothP＜ 0.05）.Compared with the acetone control group,the UVB irradiation group showed significantly increased number of melanosomes（1.85±0.32vs.1.00±0.41,P＜0.05）and autophagosomes（1.94±0.64vs.1.00±0.46,P＜0.05）in epidermal keratinocytes in mouse skin.Compared with the UVB irradiation group,the UVB+EGCG group showed significantly decreased number of melanosomes（1.30 ± 0.44,P＜ 0.05）,but significantly increased number of autophagosomes（3.03 ± 0.75,P＜ 0.05）.Immunohistochemical study showed a significant difference in the level of PAR2 in the epidermis among the 4 groups（H=18.700,P＜0.05）,and the expression of PAR2 was significantly lower in the UVB+EGCG group than in the UVB irradiation group（7.94±4.57vs.12.54±3.07,Z=2.143,P＜0.05）.However,the 4 groups all showed a low level of LC3,and there was no significant difference among the 4 groups（H=5.051,P＞ 0.05）.Western blot analysis revealed significant differences in the protein expression of PAR2 and Rab27a,as well as in the LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰratio,among the 4 groups（F=18.739,25.967,24.022,respectively,allP＜0.05）.Compared with the UVB irradiation group,the UVB+EGCG group showed significantly decreased expression of PAR2（0.91±0.54vs.3.12±0.61,P＜0.05）and Rab27a（0.99±0.16vs.1.42±0.07,P＜0.05）,but significantly increased LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰratio（1.67 ± 0.08vs.1.24 ± 0.07,P＜ 0.05）.ConclusionTopical EGCG treatment can effectively suppress UVB?induced skin pigmentation,which may be related to the inhibition of melanosome transfer and promotion of melanosome autophagy.

Polyphenols;Ultraviolet rays;Autophagy;Melanins;Epigallocatechin gallate

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81000697）;Hangzhou Science and Technology Development Program（20130733Q24）

宋秀祖，Email：songxiuzu@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（81000697）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130733Q24）

2016?10?13）

尚淑賢）