龍福泉 劉業(yè)強(qiáng) 錢(qián)伊弘 蒙秉新 趙麗詩(shī) 王千秋

200043上海市皮膚病醫(yī)院性病科（龍福泉、錢(qián)伊弘、趙麗詩(shī)），病理科（劉業(yè)強(qiáng)）；海南省人民醫(yī)院皮膚科（蒙秉新）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所性病臨床防治室（王千秋）

·論著·

腫瘤壞死因子α基因啟動(dòng)子多態(tài)性與泛發(fā)性膿皰性銀屑病相關(guān)性研究

龍福泉 劉業(yè)強(qiáng) 錢(qián)伊弘 蒙秉新 趙麗詩(shī) 王千秋

200043上海市皮膚病醫(yī)院性病科（龍福泉、錢(qián)伊弘、趙麗詩(shī)），病理科（劉業(yè)強(qiáng)）；海南省人民醫(yī)院皮膚科（蒙秉新）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所性病臨床防治室（王千秋）

目的探討腫瘤壞死因子α（TNF?α）基因啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性與泛發(fā)性膿皰性銀屑病的相關(guān)性。方法檢測(cè)對(duì)象為91例漢族泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者及102例漢族健康體檢者，應(yīng)用PCR及直接測(cè)序法分析TNF?α基因啟動(dòng)子區(qū)域?238、?308、?857位點(diǎn)多態(tài)性。結(jié)果泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者與健康對(duì)照組TNF?α?238位點(diǎn)G/A等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003；OR=4.819，95%CI：1.581～14.694），基因型GG與GA/AA在兩組間的分布差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006；OR=4.455，95%CI：1.410～ 14.077）；TNF?α?308位點(diǎn)G/A等位基因頻率以及基因型GG與GA/AA的分布在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.794、0.786）；TNF?α?857位點(diǎn)C/T等位基因頻率以及基因型CC與CT/TT的分布在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.474、0.453）。結(jié)論TNF?α?238G＞A多態(tài)性可能與泛發(fā)性膿皰性銀屑病發(fā)病相關(guān)。

銀屑??；腫瘤壞死因子α；多態(tài)性；單核苷酸；轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；泛發(fā)性膿皰性銀屑病

泛發(fā)性膿皰性銀屑病（generalized pustular psoriasis，GPP）是銀屑病的一種嚴(yán)重類(lèi)型，發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳易感因素在GPP發(fā)病機(jī)制中起到一定作用［1?2］。既往研究表明，腫瘤壞死因子α（TNF?α）基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多態(tài)性位點(diǎn)，TNF?α?238G ＞ A（rs361525）、?308G ＞ A（rs1800629）及?857C＞T（rs1799724）多態(tài)性與尋常性銀屑病及銀屑病性關(guān)節(jié)炎相關(guān)［3?4］。我們采用PCR及DNA直接測(cè)序檢測(cè)GPP與TNF?α基因啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性位點(diǎn)的相關(guān)性，探討GPP的遺傳發(fā)病機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2010年9月至2012年6月分別在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院、海南省人民醫(yī)院收集漢族GPP患者91例，其中男61例，女30例，年齡5～62（24.0±10.6）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［5］，患者之間無(wú)血緣關(guān)系。對(duì)照組為102例漢族健康體檢者，無(wú)遺傳性、家族性疾病或嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病，其中男67例，女35例，年齡11～58（26.7±9.0）歲。兩組之間性別（χ2=0.224，P＞ 0.05）及年齡（t=1.886，P＞ 0.05）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣本采集前均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

采集受試者外周血2 ml，置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，-20℃凍存。使用血液基因組DNA快速抽提試劑盒［生工生物工程（上海）有限公司］提取并純化DNA，按照試劑盒說(shuō)明操作。檢測(cè)質(zhì)量和濃度后，將提取DNA稀釋為10 mg/L，-20℃保存。PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［6?7］，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系（50 μl）含10 × 緩沖液5 μl，200 μmol/L dNTP 2 μl，P1、P2 引物（10 pmol/L）各 2 μl，小牛血清蛋白 2 μl，5 U/μl TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，超純水36 μl，5 × DNA模板2 μl。短暫混勻后，置 PCR儀上，95℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min，4℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢測(cè)，使用小量膠回收試劑盒回收，最后將回收產(chǎn)物-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

測(cè)序反應(yīng)體系：回收PCR產(chǎn)物2 μl，Big DyeTM2 μl，1 pmol/L 引物 1 μl（采用 P1 作為測(cè)序反應(yīng)引物）?；靹蚝?，96℃10 s，50℃5 s，60℃ 4 min，共25個(gè)循環(huán)，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，采用異丙醇法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，最后使用ABI Prism3700測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）電泳、測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果用DNA Star軟件包分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，計(jì)算比值比（OR）和95%可信區(qū)間（CI），以O(shè)R＞1為有病因?qū)W聯(lián)系。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

結(jié) 果

測(cè)序結(jié)果表明，GPP患者與健康對(duì)照組TNF?α啟動(dòng)子區(qū)域存在?238G＞A、?308 G＞A及?857C＞T堿基突變，3個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率以及基因型分布見(jiàn)表2。χ2檢驗(yàn)顯示，GPP患者與健康對(duì)照TNF?α?238位點(diǎn)（rs361525）G/A等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003；OR=4.819，95%CI：1.581～14.694）；基因型GG與GA/AA在兩組間的分布差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006；OR=4.455，95%CI：1.410 ～ 14.077）；TNF?α?308位 點(diǎn)（rs1800629）G/A等位基因頻率以及基因型GG與GA/AA的分布在兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.794、0.786）；TNF?α?857位點(diǎn)（rs1799724）C/T等位基因頻率以及基因型CC與CT/TT的分布在兩組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.474、0.453）。

討 論

GPP是銀屑病較為嚴(yán)重的少見(jiàn)臨床類(lèi)型，約占銀屑病患者的1.3%［8］。GPP病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，感染、藥物、糖皮質(zhì)激素突然停藥、精神壓力、內(nèi)分泌異常等因素可誘發(fā)該?。?］。Marrakchi等［9］對(duì)9 個(gè)突尼斯GPP家系患者進(jìn)行純合子定位和直接測(cè)序，首次發(fā)現(xiàn)IL36RN可能是GPP的致病基因。Sugiura等［10］和 Berki等［11］發(fā) 現(xiàn) ，CARD14c.526G ＞ C（p.Asp176His）雜合突變是尋常性銀屑病患者繼發(fā)GPP的一個(gè)重要易感因素。也有研究發(fā)現(xiàn)，TNIP1、CARD14堿基改變與GPP有關(guān)［2，12］。作為銀屑病的一個(gè)亞型，GPP顯示出其獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也與尋常性銀屑病有類(lèi)似的遺傳基礎(chǔ)。

表2 腫瘤壞死因子α（TNF?α）啟動(dòng)子區(qū)不同位點(diǎn)等位基因及基因型在泛發(fā)性膿皰性銀屑?。℅PP）患者與對(duì)照組中的頻率

TNF?α啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，Meta分析表明，TNF?α?238G＞A和?308G＞A多態(tài)性是尋常性銀屑病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)記，并可能與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［3?4，13?14］。我們既往研究也表明，TNF?α?238G＞A與早發(fā)型尋常性銀屑病有關(guān)［15］。Nishibu等［16］研究6例GPP合并關(guān)節(jié)炎患者，1例發(fā)生TNF?α?308AA純合子突變，但限于病例較少，無(wú)法從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度證明其相關(guān)性。

我們對(duì)91例GPP患者的研究表明，TNF?α?238位點(diǎn)多態(tài)性與GPP相關(guān)，TNF?α?238G＞A多態(tài)性可能是導(dǎo)致GPP的原因之一，但未發(fā)現(xiàn)?308 G＞A及?857C＞T多態(tài)性與GPP相關(guān)。將來(lái)仍需進(jìn)行大規(guī)模、多種族的臨床研究，進(jìn)一步揭示TNF?α啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性在GPP發(fā)生發(fā)展中的作用。另外，TNF?α基因在MHC中的位置特殊，TNF啟動(dòng)子基因多態(tài)性與MHCⅠ類(lèi)及Ⅱ類(lèi)基因在GPP發(fā)病中是單獨(dú)起作用還是共同發(fā)揮作用，有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)，有資料表明，TNF?α?238G ＞ A、?308 G ＞ A及?857C＞T多態(tài)性改變與尋常性銀屑病患者對(duì)TNF?α阻斷劑的敏感性相關(guān)［17］。TNF?α啟動(dòng)子區(qū)域?238G ＞ A多態(tài)性改變可能會(huì)誘導(dǎo)TNF?α高表達(dá)［7］，而TNF?α作為一種前炎癥細(xì)胞因子，可通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與GPP發(fā)病環(huán)節(jié)［18］。一些生物制劑尤其是TNF?α阻斷劑治療兒童頑固性GPP有較好療效［19?20］，進(jìn)一步說(shuō)明 TNF?α在 GPP致病機(jī)制中起到一定作用。因此，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入研究TNF?α啟動(dòng)子基因多態(tài)性是否導(dǎo)致GPP患者產(chǎn)生異?；钚缘那把装Y細(xì)胞因子TNF?α，從而影響GPP進(jìn)程，并進(jìn)而評(píng)估臨床應(yīng)用TNF?α阻斷劑治療對(duì)常規(guī)藥物抵抗的GPP患者的可行性，對(duì)GPP治療提供一個(gè)新的思路。

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Association of tumor necrosis factor?α gene promoter polymorphisms with generalized pustular psoriasis

Long Fuquan,Liu Yeqiang,Qian Yihong,Meng Bingxin,Zhao Lishi,Wang Qianqiu
Department of Venereology,Shanghai Dermatology Hospital,Shanghai 200043,China（Long FQ,Qian YH,Zhao LS）;Department of Pathology,Shanghai Dermatology Hospital,Shanghai 200043,China（Liu YQ）;Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,China（Meng BX）;Department of Sexually Transmitted Disease Clinical Management,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wang QQ）

Wang Qianqiu,Email:wangqq@ncstdlc.org

ObjectiveTo investigate the association of tumor necrosis factor?α（TNF?α）gene promoter polymorphisms with generalized pustular psoriasis.MethodsTotally,91 patients of Han nationality with generalized pustular psoriasis（generalized pustular psoriasis group）and 102 health checkup examinees（healthy control group）were enrolled into this study.PCR and direct sequencing were performed to analyze the ?238,?308 and ?857 polymorphic sites of the TNF?α promoter.ResultsThe frequency of the A allele at TNF?α?238 site was significantly higher in the generalized pustular psoriasis group than in the healthy control group（P=0.003,OR=4.819,95%CI:1.581-14.694）,so was the frequency of GA/AA genotype（P=0.006,OR=4.455,95%CI:1.410-14.077）.However,no significant differences were observed in the frequencies of G/A alleles（P=0.794）and GG/GA/AA genotypes（P=0.786）at TNF?α?308 site,or in the frequencies of C/T alleles（P=0.474）and CC/CT/TT genotypes（P=0.453）at TNF?α?857 site,between the generalized pustular psoriasis group and healthy control group.ConclusionTNF?α?238G ＞ A polymorphisms may be associated with the occur?rence of generalized pustular psoriasis.

Psoriasis;Tumor Necrosis Factor?alpha;Polymorphism,single nucleotide;Transcrip?tion Initiation Site;Generalized pustular psoriasis

Fund programs:Shanghai Municipal Natural Science Foundation（14ZR143700）；Natural Science Foundation of Hainan Province of China（813219）

王千秋，Email：wangqq@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.005

上海市自然科學(xué)基金（14ZR143700）；海南省自然科學(xué)基金（813219）

2017?03?03）

尚淑賢）