羅麗敏 李軍 劉勁松 朱紅 王鄖蓮 劉菡

442000湖北十堰，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院皮膚科（羅麗敏、劉勁松、朱紅、王鄖蓮、劉菡）；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科（李軍）

·論著·

尿緊張素Ⅱ誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的機(jī)制研究

羅麗敏 李軍 劉勁松 朱紅 王鄖蓮 劉菡

442000湖北十堰，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院皮膚科（羅麗敏、劉勁松、朱紅、王鄖蓮、劉菡）；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科（李軍）

目的探討尿緊張素Ⅱ（UⅡ）對(duì)體外培養(yǎng)人正常皮膚成纖維細(xì)胞（NF）增殖和α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α?SMA）表達(dá)的生物學(xué)功能影響及調(diào)控機(jī)制。方法原代培養(yǎng)NF，采用反轉(zhuǎn)錄PCR和Western印跡法分別檢測(cè)UⅡ及其受體mRNA和蛋白表達(dá)水平。采用CCK8法觀察不同濃度（10?10、10?9、10?8、10?7、10?6mol/L）UⅡ作用0、6、12、24、48 h對(duì)NF增殖的影響，篩選出UⅡ最佳作用濃度為10?8mol/L，刺激時(shí)間為24 h。將NF分為5組：對(duì)照組（不含UII）、UⅡ組、UⅡ +尼卡地平（鈣通道阻斷劑，10?5mol/L）組、UⅡ +PD98059［絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）抑制劑，10?5mol/L］組和UⅡ + 環(huán)孢素［鈣蛋白激酶（CaM PK）阻斷劑，10?5mol/L］組，UⅡ濃度均為10?8mol/L，刺激NF 24 h后，采用CCK8法檢測(cè)各組NF的增殖活性，以實(shí)時(shí)定量熒光PCR和Western印跡法分別檢測(cè)各組α?SMA mRNA與蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果NF表達(dá)UⅡ受體，不表達(dá)UⅡ。對(duì)照組、UⅡ組、UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+PD98059組和UⅡ+環(huán)孢素組NF細(xì)胞增殖活性（A450值）分別為1.036±0.046、1.405±0.158、1.121±0.109、1.192±0.089和1.141±0.056，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.587，P＜0.01），UⅡ組高于對(duì)照組、UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+PD98059組、UⅡ+環(huán)孢素組（q值分別為8.263、6.355、4.774、5.912，均P＜0.05）。5組間NF細(xì)胞α?SMA mRNA與蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為6.351、7.045，均P＜0.01），且UⅡ組α?SMA mRNA及蛋白表達(dá)量均高于另4組（均P＜0.05）。結(jié)論UⅡ可能通過鈣通道、MAPK和CaM PK通路誘導(dǎo)NF增殖和α?SMA的表達(dá)。

尿緊張素類；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；肌動(dòng)蛋白類；瘢痕；尿緊張素類受體

皮膚組織創(chuàng)傷愈合是體內(nèi)各種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的結(jié)果，成纖維細(xì)胞是皮膚創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，血管活性因子是內(nèi)環(huán)境中影響皮膚病理生理變化的重要因素［1］。而成纖維細(xì)胞的增殖和α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α?SMA）的表達(dá)在皮膚組織的創(chuàng)傷愈合過程中發(fā)揮重要作用。尿緊張素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是一種新型活性肽，UⅡ及其受體廣泛分布于全身多種臟器，是目前已報(bào)道的體內(nèi)最強(qiáng)的收縮血管活性肽［2］。我們發(fā)現(xiàn)，UⅡ能促進(jìn)正常皮膚成纖維細(xì)胞（normal dermal fibroblast，NF）遷移及Ⅰ型膠原蛋白產(chǎn)生和分泌［3］。本研究中我們離體原代培養(yǎng)NF，驗(yàn)證NF是否表達(dá)UⅡ及其受體，并探討UⅡ?qū)F增殖和α?SMA表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.皮膚標(biāo)本：標(biāo)本取自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院泌尿外科3～9歲男性兒童包皮環(huán)切術(shù)后切掉的正常包皮組織。本研究通過湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兒童監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

2.主要試劑：兔抗人UⅡ多克隆抗體、兔抗人UⅡ受體和兔抗人α?SMA單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），兔抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司），UⅡ［圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司］，尼卡地平、PD98059和環(huán)孢素（德國(guó)Calbiochen公司），胰酶細(xì)胞消化液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK8（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），胎牛血清和高糖DMEM血清（美國(guó)Gibco公司），中性蛋白酶Ⅱ（美國(guó)Roche公司），總RNA提取試劑Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT?PCR）試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)［4］。臨床收集的正常包皮組織標(biāo)本，用含青鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗，75%乙醇消毒，修剪去除皮下組織，將組織塊剪成1～2 cm2，加入含0.25%的中性蛋白酶Ⅱ的溶液于4℃冰箱過夜，隔日取出組織塊，去除表皮，將組織塊剪成1 mm3大小平鋪于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后換液，以后隔日換液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到80%融合，用0.25%胰酶消化傳代，取3～5代原代培養(yǎng)的NF進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)UⅡ和UⅡ受體mRNA表達(dá)和實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)α?SMA mRNA表達(dá)：NF總RNA提取和mRNA反轉(zhuǎn)錄參照試劑公司說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物用含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mRNA表達(dá)量。實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，根據(jù)熒光信號(hào)繪制基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，用2?ΔΔCt的方法計(jì)算UⅡ、UⅡ受體、α?SMA的mRNA相對(duì)表達(dá)量。以β肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參。UⅡ、UⅡ受體、α?SMA和β肌動(dòng)蛋白引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

3.Western印跡法檢測(cè)α?SMA蛋白表達(dá)：裂解培養(yǎng)的NF后以BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣20 μg蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濕法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗：兔抗人UⅡ多克隆抗體（稀釋比例1∶500）、兔抗人UⅡ受體單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人α?SMA單克隆抗體（1∶1 000）或兔抗人GAPDH單克隆抗體（陽性參照，1∶2 000），4℃冰箱孵育過夜，加入二抗即辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫孵育2 h，增敏化學(xué)發(fā)光法顯影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果予Image Lab軟件分析，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

4.CCK8法檢測(cè)NF的細(xì)胞活性：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NF，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到2 × 104個(gè)/ml，接種于96孔板（100 μl/孔），設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，使NF貼壁；次日倒掉培養(yǎng)液，加入含不同干預(yù)藥物的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h；隔日在每孔中加入10 μl WST?8溶液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，取出96孔板，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A450值）。

表1 反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物序列

三、鑒定UⅡ和UⅡ受體在NF中的表達(dá)

采用前述方法，取3～5代原代培養(yǎng)的NF，提取RNA及蛋白后，分別采用反轉(zhuǎn)錄PCR和Western印跡法鑒定UⅡ和UⅡ受體在NF中的表達(dá)。

四、檢測(cè)UⅡ濃度與作用時(shí)間對(duì)NF增殖的影響

以UⅡ濃度為 0（濃度對(duì)照組）、10?10、10?9、10?8、10?7、10?6mol/L的無血清DMEM培養(yǎng)液孵育NF 細(xì)胞24 h，采用CCK8法檢測(cè)NF細(xì)胞的增殖活性，用酶標(biāo)儀讀取A450值，篩選出UⅡ促進(jìn)NF細(xì)胞增殖的最佳濃度用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。NF中加入外源性UⅡ（濃度為10?8mol/L），予無血清DMEM培養(yǎng)液孵育0（時(shí)間對(duì)照組）、6、12、24、48 h后，CCK8法檢測(cè)NF細(xì)胞的增殖活性，用酶標(biāo)儀讀取A450值，篩選出UII促進(jìn)NF細(xì)胞增殖的最佳作用時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

五、檢測(cè)通路阻斷劑對(duì)UⅡ促進(jìn)NF增殖與α?SMA表達(dá)的影響

將NF接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并達(dá)到80%融合時(shí)，用含1%BSA的DMEM培養(yǎng)液同步培養(yǎng)NF細(xì)胞24 h，然后同時(shí)加入不同的藥物進(jìn)行干預(yù)，具體分組如下：對(duì)照組（不含UII）、10?8mol/L UⅡ組、10?8mol/L UⅡ+10?5mol/L尼卡地平（鈣通道阻斷劑）組、10?8mol/L UⅡ+10?5mol/L PD98059［絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）抑制劑］組和10?8mol/L UⅡ+10?5mol/L環(huán)孢素［鈣蛋白激酶（CaM PK）阻斷劑］組。藥物刺激NF 24 h后采用CCK8法檢測(cè)各組NF細(xì)胞的增殖活性，用酶標(biāo)儀讀取A450值；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡法分別檢測(cè)α?SMA mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

六、統(tǒng)計(jì)方法

用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)最少3次，結(jié)果采用方差齊性檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、UⅡ和UⅡ受體在NF中的表達(dá)

NF在基因和蛋白水平均不表達(dá)UⅡ，但表達(dá)UⅡ受體。見圖1、2。

二、不同濃度UⅡ及作用時(shí)間對(duì)NF增殖的影響

0（對(duì)照組）、10?10、10?9、10?8、10?7、10?6mol/L UⅡ組間NF的增殖活性（A值）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.810，P＜ 0.01），10?9、10?8、10?7、10?6mol/L 組（1.248 ±0.082、1.359 ± 0.105、1.305 ± 0.098、1.258 ± 0.044）高于對(duì)照組（1.027± 0.158）（q值分別為4.842、7.274、6.091、5.074，均P＜ 0.05）；而10?10mol/L UⅡ組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以10?8mol/L時(shí)的增殖活性最高，將該濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

10?8mol/L UⅡ刺激NF 0（對(duì)照組）、6、12、24、48 h后細(xì)胞增殖活性（A值）組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.059，P＜ 0.01），12、24、48 h時(shí)（1.201 ± 0.053、1.268±0.093、1.206±0.071）高于對(duì)照組（1.033±0.090）（q值分別為4.956、6.918、5.092，均P＜ 0.05）；而6 h UⅡ組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以24 h時(shí)最高，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、不同信號(hào)通路阻斷劑對(duì)UⅡ促進(jìn)NF增殖及α?SMA表達(dá)的影響

對(duì)照組、UⅡ組、UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+PD98059組、UⅡ+環(huán)孢素組間NF細(xì)胞增殖活性（A值）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），UⅡ組高于對(duì)照組、UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+PD98059組、UⅡ+環(huán)孢素組（q值分別為 8.263、6.355、4.774、5.912，均P＜ 0.05）。見表2。α?SMA mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。UⅡ組α?SMA mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組、UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+PD98059組、UⅡ+環(huán)孢素組（q值分別為6.339、5.583、4.972、5.145，均P＜ 0.05）；α?SMA蛋白表達(dá)量亦高于另4組（q值分別為6.511、4.798、5.496、6.190，均P＜ 0.05）。見表2、圖3。

圖1 反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定尿緊張素Ⅱ及其受體mRNA在成纖維細(xì)胞中的表達(dá) 1：標(biāo)準(zhǔn)參照物，2：β肌動(dòng)蛋白（285 bp），3：尿緊張素Ⅱ（141 bp），4：尿緊張素Ⅱ受體（319 bp）

圖2 Western印跡鑒定尿緊張素Ⅱ及其受體在成纖維細(xì)胞中的表達(dá) 1、2、3為成纖維細(xì)胞蛋白樣本序號(hào)

表2 不同信號(hào)通路阻斷劑對(duì)尿緊張素Ⅱ（UⅡ）促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α?SMA）表達(dá)的影響（±s）

表2 不同信號(hào)通路阻斷劑對(duì)尿緊張素Ⅱ（UⅡ）促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α?SMA）表達(dá)的影響（±s）

注：n=5。a與UⅡ組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；b以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示

增殖活性（A450）1.036±0.046a 1.405±0.158 1.121±0.109a 1.192±0.089a 1.141±0.056a 9.587＜0.01組別對(duì)照組UⅡ組UⅡ+尼卡地平組UⅡ+PD98059組UⅡ+環(huán)孢素組F值P值α?SMA mRNA（2?ΔΔCt）1±0a 1.721±0.259 1.086±0.203a 1.156±0.149a 1.136±0.253a 6.351＜0.01 α?SMA蛋白b 1.067±0.044a 1.615±0.204 1.211±0.145a 1.153±0.143a 1.094±0.144a 7.045＜0.01

圖3 不同信號(hào)通路阻斷劑對(duì)尿緊張素Ⅱ（UⅡ）促進(jìn)成纖維細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α?SMA）表達(dá)的影響 1～5：分別為對(duì)照組、UⅡ組、UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+PD98059組、UⅡ+環(huán)孢素組

討 論

皮膚創(chuàng)傷后，NF的增殖和遷移是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵因素［1］。α?SMA是成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志，成纖維細(xì)胞持續(xù)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使創(chuàng)面收縮，加速創(chuàng)口愈合。一般情況下，肌成纖維細(xì)胞很快消失，然而病理狀態(tài)下肌成纖維細(xì)胞的持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致病理性瘢痕和皮膚組織纖維化［5?6］。

UⅡ首先由Pearson等［7］于1980年從硬骨魚尾垂體分離出來，是一種類似于生長(zhǎng)抑素的環(huán)狀結(jié)構(gòu)血管活性肽。人源UⅡ于1998年由Coulouarn等［8］發(fā)現(xiàn)，是一種強(qiáng)烈的血管收縮因子，其基因位于染色體1p36 ～ 1p32。1999年Ames等［9］首次證實(shí)，人體內(nèi)存在一種孤立的G蛋白偶聯(lián)受體GPR14，是UⅡ的特異性受體，具有7個(gè)跨膜段，后來將其命名為UⅡ受體，又稱為孤兒受體。UⅡ和UⅡ受體分布于體內(nèi)多種組織和器官，廣泛表達(dá)于心血管系統(tǒng)、肺臟、中樞神經(jīng)、腎臟和代謝系統(tǒng)等臟器［10］。UⅡ可能參與組織和器官纖維化的發(fā)生，Remst等［11］研究認(rèn)為，UⅡ可促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜纖維化的進(jìn)程。Pehlivan等［12］認(rèn)為，血漿UⅡ水平升高可能與硬皮病纖維化有關(guān)，而應(yīng)用UⅡ拮抗劑帕洛舒侖（palosuran）后能減緩硬皮病病情的進(jìn)展［13］。因此，UⅡ和UⅡ受體可能成為皮膚組織纖維化治療干預(yù)的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，UⅡ能促進(jìn)NF產(chǎn)生和分泌Ⅰ型膠原蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)UⅡ能促進(jìn)NF遷移，上述作用能不同程度地被Ca2+、CaM PK及MAPK阻斷劑抑制，提示UⅡ可以誘導(dǎo)NF遷移和膠原分泌，并且與Ca2+、CaM PK及MAPK等通路相關(guān)［3］。但上述實(shí)驗(yàn)僅從旁分泌的角度對(duì)UⅡ的功能進(jìn)行了初步探討，未能證實(shí)NF上是否存在UⅡ及其受體。我們發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的NF不表達(dá)UⅡ基因和蛋白，而UⅡ受體則均有表達(dá)，提示UⅡ不能由NF合成，其生物學(xué)效應(yīng)不是由自分泌，而是通過旁分泌的方式來起作用。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，UⅡ能促進(jìn)NF增殖，在UⅡ?yàn)?0?8mol/L刺激24 h時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，UⅡ也能促進(jìn)NF中α?SMA mRNA和蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。加入鈣通道阻斷劑尼卡地平、CaM PK阻斷劑環(huán)孢素和MAPK阻斷劑PD98059后，UⅡ促NF增殖、α?SMA表達(dá)的作用被不同程度抑制，提示UⅡ促NF增殖和α?SMA表達(dá)的作用與Ca2+、CaM PK和MAPK通路相關(guān)。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)NF上存在UⅡ受體，UⅡ主要通過旁分泌方式來實(shí)現(xiàn)其對(duì)NF增殖和α?SMA表達(dá)的調(diào)控。由于血管活性因子是皮膚維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，而UⅡ在皮膚新陳代謝和創(chuàng)傷修復(fù)過程中具有重要作用，所以UⅡ?qū)F增殖和α?SMA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究可能為皮膚創(chuàng)傷愈合、病理性瘢痕及硬皮病等疾病的防治開拓新的途徑。

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Mechanisms underlying the urotensin Ⅱ ?induced proliferation of and α ?smooth muscle actin expressioninhumandermalfibroblasts

LuoLimin,LiJun,LiuJinsong,ZhuHong,WangYunlian,LiuHan Department of Dermatology,Dongfeng General Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China（Luo LM,Liu JS,Zhu H,Wang YL,Liu H）;Department of Cardiology,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China（Li J）

Liu Han,Email:liuhansy@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the effects of urotensin Ⅱ on cell proliferation of and α?smooth muscle actin（α ?SMA）expression in normal human dermal fibroblasts（NFs）,and to explore their regulatory mechanisms.MethodsNFs were isolated from foreskin tissues and subjected to primary culturein vitro.Reverse transcription PCR and Western blot analysis were performed to measure the mRNA and protein expression of urotensin Ⅱ and its receptor,respectively.Cell counting kit?8（CCK?8）assay was conducted to estimate the proliferation of NFs,which were treated with urotensinⅡat different concentrations of 0,10?10,10?9,10?8,10?7and 10?6mol/L for 0,6,12,24 and 48 hours separately,and then the optimal concentration and duration of urotensin Ⅱ exposure were selected to be 10?8mol/L and 24 hours respectively.Some cultured NFs were divided into 5 groups:control group receiving no treatment,UⅡgroup treated with 10?8mol/L urotensin Ⅱ,UⅡ+nicardipine group treated with 10?8mol/L urotensin Ⅱ and the calcium channel blocker nicardipine at the concentration of 10?5mol/L,UⅡ+PD98059 group treated with 10?8mol/L urotensin Ⅱ and the mitogen activated protein kinase（MAPK）inhibitor PD98059 at the concen?tration of 10?5mol/L,and UⅡ+cyclosporine group treated with 10?8mol/L urotensin Ⅱ and the calcium?dependent protein kinase（CaM PK）inhibitor cyclosporine at the concentration of 10?5mol/L.After 24?hour treatment,CCK?8 assay was conducted to evaluate the proliferation of NFs in the above groups,real?time fluorescence?based quantitative PCR and Western blot analysis were performed to determine the mRNA and protein expression of α?SMA respectively.ResultsUrotensin Ⅱ receptor was expressed in NFs,but urotensinⅡwas not.The proliferative activity of NFs significantly differed among the control group,UⅡgroup,UⅡ+nicardipine group,UⅡ+PD98059 group and UⅡ+cyclosporine group（the mean absorbance value at 405 nm:1.036±0.046,1.405±0.158,1.121±0.109,1.192±0.089 and 1.141±0.056,respectively;F=9.587,P＜0.01）,and the UⅡ group showed significantly higher proliferative activity of NFs compared with the control group,UⅡ+nicardipine group,UⅡ+PD98059 group and UⅡ+cyclosporine group（q=8.263,6.355,4.774 and 5.912,respectively,allP＜ 0.05）.There were significant differences in the mRNA and protein expression of α?SMA among the 5 groups（F=6.351,7.045,bothP＜0.01）,and the mRNA and protein expression of α?SMA was significantly higher in the UⅡ group than in the other 4 groups（allP＜ 0.05）.ConclusionUrotensinⅡ may induce the proliferation of and α?SMA expression in NFs through calcium channels,MAPK and CaM PK pathways.

Urotensins;Fibroblasts;Cell proliferation;Actins;Cicatrix;Receptor,urotensins

Fund programs:Science and Technology R&D Program of Shiyan City（15Y54）;Science and Technology Special Program of Taihe Hospital in Shiyan City（2014PY03）

劉菡，Email：liuhansy@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.12.008

十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（15Y54）；十堰市太和醫(yī)院科研專項(xiàng)計(jì)劃（2014PY03）

2016?12?12）

朱思維 顏艷）