韓松 陸宇 董韜 于春泳 李曉明 潘冬生 馮思哲

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽 110016)

異檸檬酸脫氫酶-1突變與膠質瘤化療療效關系的初步研究

韓松 陸宇 董韜 于春泳 李曉明 潘冬生 馮思哲*

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽 110016)

目的回顧性研究人腦膠質瘤患者46例中異檸檬酸脫氫酶-1(IDH1) R132H變異與其化療療效的關系。方法采用建立的MGB雙熒光探針實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)方法檢測患者IDH1基因R132H突變，同時根據(jù)臨床隨訪獲得患者化療預后情況，比較IDH1基因132位點突變與野生型患者化療預后及生存分析。結果單因素分析IDH1基因突變的繼發(fā)性膠質母細胞瘤(sGBM)患者化療后有更長的無進展生存期(PFS)和總體生存期(OS) (P<0.001)，患者年齡小于50歲，行為狀態(tài)評分(KPS)大于80均有較長的PFS和OS；多因素分析(COX回歸分析)中，IDH1基因突變與PFS和OS呈顯著正相關(P<0.001)；TMZ化療顯示IDH1基因突變中有效組患者為47.2%，IDH1基因野生型中有效組患者為10.0%，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。生存分析顯示替莫唑胺(TMZ)化療患者IDH1基因突變有更長的PFS。結論本實驗結果分析顯示IDH1基因R132H突變是sGBM患者TMZ化療療效的敏感指標之一，為后續(xù)sGBM治療提供新的參考選擇。

膠質瘤; IDH1突變; 診斷; 治療

人腦膠質瘤是常見的顱內腫瘤類型之一，其中最嚴重的是WHO Ⅳ級膠質瘤，即膠質母細胞瘤，患者通常伴有嚴重的認知功能障礙并在短時間內(≤1 年)死亡[1]。低級別膠質瘤預后程度不一，其結果受腫瘤組織病理學分型及治療方式的多重影響。由于膠質瘤的組織特異性，臨床上主要的治療方法是采用手術切除聯(lián)合放射及化學藥物治療。

異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)突變在 WHO Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤患者中均有發(fā)生。在WHO Ⅱ級膠質瘤中，IDH1突變率為50%～80%[2]；在 WHO Ⅱ～Ⅲ級膠質瘤(包括星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤)的共同檢測中，IDH1突變率達70%以上[3]；在WHO Ⅳ級膠質瘤中，IDH1突變率在繼發(fā)性腫瘤中為70%～80%，而在原發(fā)性腫瘤中僅不到10%[4]。很多回顧性研究證實了IDH1突變與膠質瘤患者預后的關系，前瞻性的研究中也有所報道。在德國的一項多中心(German Glioma Network, GGN)前瞻性的膠質瘤研究中[5]，分析了突變與患者預后的相關性，其中16位IDH1突變的多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiform, GBM)患者中位數(shù)總生存期為30個月，270位IDH1野生型GBM患者的中位數(shù)總生存期僅為11.2個月，并且IDH1突變患者無進展生存期(progression-free survival, PFS)也明顯長于IDH1野生型者[相對危險率(relative risk, RR): 0.42; 95%可信區(qū)間(confidence interval, CI), 0.19～0.91;P=0.028]。IDH1突變作為膠質瘤新的強有力的預后指標是否與化療藥物的療效有一定的相關性，目前國內的相關報道較少。本研究納入繼發(fā)性多形性膠質母細胞瘤(secondary glioblastoma multiform, sGBM)患者46例，分析IDH1基因R132H突變，以及給予口服替莫唑胺(temozolomide, TMZ)化療6～18個療程，分析IDH1突變與患者臨床預后的關系。

材料與方法

一、一般資料

收集2009年1月至2015年12月經(jīng)手術證實的繼發(fā)性膠質瘤母細胞(sGBM)腫瘤石蠟包埋組織46例?；颊叩呐R床資料可通過沈陽軍區(qū)總醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)進行查詢，患者的隨訪主要通過電話隨訪和門診隨訪兩種方式?；颊叩娜脒x標準：①患者最后一次手術時年齡在18歲以上(包括18歲)；②既往有病理組織學上明確的低級別膠質瘤和間變性膠質瘤證據(jù)；③有詳細的臨床資料和隨訪數(shù)據(jù)；④有足夠的腫瘤標本；⑤住院時間2009年1月到2015年12月，接受TMZ治療；⑥至少接受過2個療程的TMZ治療后再進行TMZ療效的評價(臨床癥狀和體征以及影像學表現(xiàn)；在做基因學檢測之前所有的腫瘤標本都經(jīng)過兩位神經(jīng)病理學專家再次審閱，所有患者的影像學資料都經(jīng)過兩位神經(jīng)影像學專家和一位神經(jīng)外科專家在不知道標本基因檢測結果的情況下審閱。

二、主要試劑及儀器

組織基因組DNA提取試劑盒購于Qiagen公司，T-easy克隆試劑盒購于Promega公司，質粒小提試劑盒購于上海生工公司，DNA純化試劑盒購于Qiagen公司，PCR擴增試劑購于Takara公司，其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純，引物及MGB熒光探針由上海生工合成，臺式高速冷凍離心機(Thermo)，實時熒光定量PCR儀(上海宏石，SLAN)。

三、研究方法

①IDH1基因R132H位點檢測方法的建立 組織基因組DNA提取 取 10 μm 蠟塊切片(1.5 cm×2 cm) 5張進行二甲苯處理，加1 mL二甲苯，65 ℃恒溫震蕩10 min，10 700 r/min， 離心5 min，去上清，重復二甲苯處理 3 次。加無水乙醇1 mL，混勻，10 700 r/min，離心 5 min，去上清，以95%、75% 乙醇各離心沉淀1次?？諝飧稍锖?，嚴格按照Qiagen組織基因組DNA提取試劑和說明書操作，提取的基因組DNA置于-20 ℃?zhèn)溆?。②雙色熒光PCR法檢測IDH1基因R132H突變方法的建立 IDH1基因132位點突變R為野生型探針用FAM標記，H為突變型探針用HEX標記。上游引物序列：5'-CG GCTTGTGAGTGGATGGGT-3'； 下游引物序列：5'-GCTTA ATGGGTGTAGATACC-3'；R探針序列：5'-FAM-CATAG GTCGTC ATGCTTAT-MGB-3'；H探針序列：5'-HEX-CAT AGGTCATCATGCTTAT-MGB-3'。PCR反應體系為30 μL，其中DNA模板1 μL；上下游引物濃度為0.2 μmol/L，探針濃度為0.3 μmol/L(R與H各0.15 μmol/L)，Mg2+濃度為3.5 mmol/L，1.25 U Taq DNA；PCR反應條件為94 ℃預變性3 min；之后94 ℃變性15 s，62 ℃退火40 s(雙通道采集熒光)；40個循環(huán)。③結果判定：根據(jù)典型的特異性擴增曲線判讀相應型別，F(xiàn)AM 擴增為R野生型，HEX擴增為H突變型。

四、替莫唑胺(temozolomide, TMZ)化療療效評價

46例患者都有病理證實的低級別膠質瘤或者間變性膠質瘤病史，并且既往行手術切除和術后規(guī)范的放射治療但沒有化療。復發(fā)后經(jīng)病理確認由原有的低級別膠質瘤進展為sGBM。故予以TMZ化療。通過觀察TMZ化療對殘余腫瘤的影響，來判斷IDH1基因R132H突變與TMZ療效的關系。TMZ的化療方案：口服TMZ 200 mg/m2/d，連續(xù)用藥5 d，28 d為一個療程。每兩個療程后隨訪一次。包括臨床癥狀和體征的檢查以及磁共振平掃加增強檢查，(按照MacDonald標準執(zhí)行[6])具體判定標準是：部分有效(partial response, PR)：腫瘤體積縮小50%以上；輕微起效(minor response, MR)：腫瘤體積縮小25%～50%之間；腫瘤進展(disease progression, DP)：腫瘤體積增加超過25%或者患者腫瘤相關的神經(jīng)功能障礙逐漸加重；病情穩(wěn)定(stable disease, SD)：上述幾種情況都不符合并且持續(xù)4個TMZ療程以上；判斷腫瘤進展時要注意區(qū)分其與腫瘤的假性進展(pseudoprogression)和假性應答(pseudoresponse)[7]。

五、統(tǒng)計學分析

所有統(tǒng)計學計算均使用SPSS 16.0軟件完成。計數(shù)資料采用卡方檢驗進行差異性分析，獨立樣本t檢驗用來分析IDH1突變陽性組和IDH1突變陰性組的年齡差別。無進展生存期(progression-free survival, PFS)和總體生存期(overall survival, OS)用來反映患者的預后情況。應用Kaplan-Meier法檢驗生存分析、Log-rank法顯著性檢驗以比較不同患者的生存差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者基本臨床資料

共有46例繼發(fā)性GBM患者納入研究，患者基本資料詳見表1。

表1 46例繼發(fā)性GBM患者臨床資料

Tab 1 Clinical data of 46 patients with secondary GBM

二、單因素分析IDH1基因突變與患者TMZ化療療效關系

按照建立的方法檢測，IDH1突變發(fā)生率為78.26%(36/46)，統(tǒng)計分析結果表明IDH1基因突變的sGBM患者化療后有更長的PFS和OS(P<0.001)，患者年齡和KPS評分都與PFS和OS相關。年齡小于50歲，KPS評分大于80均有較長的PFS和OS。見表2。

表2 單因素分析臨床資料及IDH1基因突變與患者PFS和OS關系(卡方檢驗)

Tab 2 Relationship between PFS and OS of clinical data and IDH1 gene mutations in patients by univariate analysis (chi square test)

VariablesnPFS(month)PvalueOS(month)Pvalue Sex Male2510.40.90310.80.746 Female2110.111.6 Age(year) ≤503312.6<0.00112.4<0.001 >50137.39.3 KPSgrade ≤80199.50.02110.40.019 >802711.413.6 IDH1mutation R(Wildtype)106.6<0.0018.6<0.001 H(Mutation)3612.412.6

三、多因素分析IDH1基因突變與患者TMZ化療療效關系

多因素分析(COX回歸分析)表明，IDH1基因突變與PFS和OS呈顯著正相關(P<0.001)。詳見表3。

表3 多因素分析臨床資料及IDH1基因突變與患者PFS和OS關系(Cox回歸分析)

Tab 3 The relationship beween PFS and OS of clinical data and IDH1 gene mutations in patients by multivariate analysis (Cox regression)

VariablePFSPvalueHROSPvalueHR Age≤50years0.7331.1460.7151.150 KPSgrade>800.1950.7880.1920.790 IDH1H(Muta-tion)<0.0010.104<0.0010.104

四、Kaplan-Meier法生存分析IDH1基因突變與患者PFS之間關系

患者接受TMA治療的療程中位數(shù)是6個療程(2～18個療程)。46例患者接受TMZ治療后，8例部分有效(17.4%)，9例輕微起效(19.6%)，7例病情穩(wěn)定(15.2%)，21例患者出現(xiàn)病情惡化(45.7%)，有效組(包括輕微有效，部分有效和病情穩(wěn)定)，IDH1基因突變中有效組患者為17例(17/36, 47.2%)，IDH1基因野生型中有效組患者為1例(1/10, 10.0%)兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。生存分析顯示IDH1基因突變患者有更長的PFS(圖1)。

圖1 生存分析IDH1 突變與患者PFS 之間關系

Fig 1 The relationship between IDH1 mutation and PFS by survival analysis

討 論

GBM是成年人中最常見、惡性程度最高的腦腫瘤[8]，也是惡性膠質瘤中最常見的類型[9]，其年發(fā)病率約為3/10萬～5/10萬[10-11]，可發(fā)生在任何年齡段，最常發(fā)生在老年人(年齡的中位數(shù)為64歲；sGBM患者發(fā)病年齡要稍年輕，年齡的中位數(shù)為45歲)，很少發(fā)生在兒童患者[11-13]。GBM具有很高的致殘和致死率，嚴重威脅人類健康，而其治療前景至今仍然不容樂觀。即使經(jīng)過最大程度上的手術切除和術后規(guī)范的CCRT，GBM患者的中位PFS和OS也僅僅只有7個月和15個月[14-15]。90%以上的GBM是原發(fā)性的，病程進展很快，從幾天到幾周不等。約10%的GBM是繼發(fā)性的，是由WHO Ⅱ或Ⅲ級膠質瘤逐漸進展而來[10,13,16]。兩者具有截然不同的分子生物學轉導通路。

歐洲癌癥治療研究組織(European Organization for Research on Treatment of Cancer, EORTC)與加拿大國家癌癥研究院(National Cancer Institute of Canada, NCIC)合作，進行了一項具有里程碑式意義的大樣本、多中心III期臨床實驗(EORTC trial 26981/22981 and NCIC trial CE.3)研究，研究發(fā)現(xiàn)，在85個中心的573例GBM患者的綜合治療中，單純放療組和放療輔以TMZ化療組的中位生存期分別為12.1個月和14.6個月，2年生存率分別為10.4%和26.5%，表明在單純放療的基礎上輔以TMZ可以使生存期延長[14]。前期的研究表明[5]，MGMT啟動子甲基化是GBM患者對TMZ化療的療效的一個敏感指標，但最近的研究顯示MGMT啟動子甲基化的WHO Ⅲ級的間變性膠質瘤患者，不管術后是單純放療還是單純的TMZ或者PCV化療，都具有更長的PFS和OS[17]。因此，到目前為止MGMT啟動子甲基化影響患者臨床結局的機制仍然不清楚。

IDH1基因突變導致編碼區(qū)變異132位點突變(由R突變?yōu)镠)，占總R132位點突變的98%以上，本研究只檢測了R132H突變形式[18]。本研究證實IDH1基因突變廣泛存在于sGBM中，突變發(fā)生率為78.26%(36/46)，單因素及多因素分析顯示IDH1基因R132H突變是sGBM患者TMZ化療療效的敏感指標之一。但目前IDH1基因突變影響患者臨床預后仍沒有合理的解釋。推測可能是IDH1喪失原有蛋白活性減緩了腫瘤生長，并且抑制細胞的抗氧化應激能力，從而促進化療藥物誘導細胞凋亡。

基于分子遺傳學指標的人腦膠質瘤分型終究會取代傳統(tǒng)病理組織學分型，因為前者更具個體化，更能體現(xiàn)各型膠質瘤的不同發(fā)病機制，為臨床治療提供潛在的治療靶點，這無疑是傳統(tǒng)病理組織學分型難以實現(xiàn)的。在今后的sGBM和GBM臨床診治和臨床試驗中，要綜合考慮MGMT啟動子甲基化和IDH1基因突變對患者臨床預后的影響。

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Therelationshipbetweenisocitratedehydrogenasegenemutationandchemotherapyingliomas:apreliminarystudy

HANSong,LUYu,DONGTao,YUChunyong,LIXiaoming,PANDongsheng,FENGSizhe

DepartmentofNeurosurgery,TheGeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110016, China

ObjectiveThe relationship between IDH1 R132H variation in 46 patients with glioma and the chemotherapy efficacy was invesigated.MethodsThe real-time fluorescence quantitative PCR (MGB) method was used to detect the R132H mutation of IDH1 gene. At the same time, the prognosis of patients with chemotherapy was obtained by clinical follow-up. The prognosis of chemotherapy and survival analysis was compared between the patients with IDH1 R132H variation and the wild-type patients.ResultsUnivariate analysis showed that the patients with secondary glioblastoma (sGBM) with IDH1 mutations had longer PFS and OS after chemotherapy (P<0.001); the patients younger than 50 years and with KPS scores >80 had longer PFS and OS (P<0.001). Multivariate analysis (COX regression analysis) showed that IDH1 gene mutation was positively correlated with PFS and OS (P<0.001). Effective group of patients with IDH1 gene mutation and wild-type was 47.2% and 10.0%, respectively. The difference between two groups was statistically significant (P<0.001). Survival analysis showed that TMZ patients with IDH1 gene mutations had longer PFS.ConclusionThe results of this study show that IDH1 gene R132H mutation is a sensitive indicator of TMZ chemotherapy in patients with sGBM, which provides a new reference for subsequent treatment of sGBM.

Glioma; IDH1 mutation; Diagnosis; Treatment

Cell transplantation therapy for spinal cord injury

AssinckP1,2,DuncanGJ1,3,HiltonBJ1,3,PlemelJR4,TetzlaffW1,3,5

1International Collaboration on Repair Discoveries, University of British Columbia, Vancouver, Canada;2Graduate Program in Neuroscience, University of British Columbia, Vancouver, Canada;3Department of Zoology, University of British Columbia, Vancouver, Canada;4Department of Clinical Neurosciences and the Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary, Calgary, Canada; 5Department of Surgery, University of British Columbia, Vancouver, Canada

R 739

A

1671-2897(2017)16-212-05

韓松，主治醫(yī)師，E-mail: drhansong@126.com

*通訊作者： 馮思哲，主任醫(yī)師，E-mail: fengsizhe@sohu.com

2016-12-05；

2017-03-22)

AbstractSpinal cord injury can lead to severe motor, sensory and autonomic dysfunction. Currently, there is no effective treatment for the injured spinalcord. The transplantation of Schwann cells, neural stem cells or progenitor cells, olfactory ensheathing cells, oligodendrocyte precursor cells and mesenchymal stem cells has been investigated as potential therapies for spinal cord injury. However, little is known about the mechanisms through which these individual cell types promote repair and functional improvements. The five most commonly proposed mechanisms include neuroprotection, immunomodulation, axon regeneration, neuronal relay formation and myelin regeneration. A better understanding of the mechanisms whereby these cells promote functional improvements, as well as an appreciation of the obstacles in implementing these therapies and effectively modeling spinal cord injury, will be important to make cell transplantation a viable clinical option and may lead to the development of more targeted therapies.

10.1038/nn.4541