朱虹帆 陳典剛 呂勝青 湯金梁 王東林 李光輝

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院: 1全軍腫瘤研究所, 2神經(jīng)外科, 3病理科，重慶 400037; 4重慶市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，重慶 400030)

·腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤診治研究·

CEP55在人膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)及對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響

朱虹帆1陳典剛1呂勝青2湯金梁3王東林4李光輝1*

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院:1全軍腫瘤研究所,2神經(jīng)外科,3病理科，重慶 400037;4重慶市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，重慶 400030)

目的檢測中心體相關(guān)蛋白55(CEP55)在人膠質(zhì)瘤組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平；抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中CEP55表達(dá)，觀察其對U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法實時熒光定量聚合酶連鎖反應(yīng)(q-PCR)、蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測40例不同級別人膠質(zhì)瘤組織和10例正常腦組織中CEP55的表達(dá)；RNAi抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞CEP55基因表達(dá)，采用細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒(CCK-8)和胸腺嘧啶核苷類似物(edu)檢測CEP55對U251細(xì)胞增殖的影響，采用流式細(xì)胞儀分析CEP55對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果CEP55在40例人膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著高于正常腦組織(P<0.01)，但高級別膠質(zhì)瘤CEP55的表達(dá)與低級別膠質(zhì)瘤沒有顯著差異(P>0.05)。在RNAi抑制U251細(xì)胞CEP55表達(dá)后，細(xì)胞的增殖顯著受抑(P<0.01)，細(xì)胞的凋亡顯著增加(P<0.01)。結(jié)論人膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞較正常腦組織CEP55表達(dá)明顯增高，抑制CEP55的表達(dá)抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖，同時促進(jìn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

中心體相關(guān)蛋白55; 膠質(zhì)瘤; U251細(xì)胞; 增殖; 凋亡

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，約占顱內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的80%，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有腫瘤的30%，是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤[1]。近30年，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率逐年增高，年增長率達(dá)1%～2%，且隨著年齡的增長發(fā)病率呈上升趨勢。盡管隨著影像技術(shù)、手術(shù)、放療、化療和靶向治療等各種治療手段的發(fā)展，以及多學(xué)科綜合治療的實施，膠質(zhì)瘤的2年生存率由10.4%提高到26.5%，膠質(zhì)瘤的總體治療效果仍欠佳，最終仍將導(dǎo)致患者的死亡。目前成人的高級別膠質(zhì)瘤1年和5年生存率仍僅為30%和13%[2]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞有著復(fù)雜的基因突變、表達(dá)異常的遺傳背景，膠質(zhì)瘤的治療抵抗、易復(fù)發(fā)可能與其導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞間廣泛的異質(zhì)性相關(guān)[3-4]。因此，對膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展相關(guān)調(diào)控分子機制的研究既可促進(jìn)對其生物學(xué)行為的深入理解，又能為不同的治療新策略提供理論基礎(chǔ)。

中心體相關(guān)蛋白55(centrosomal protein 55, CEP55)是新近發(fā)現(xiàn)的有絲分裂磷蛋白，是中心體相關(guān)蛋白中中間體環(huán)的重要組成部分，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的分裂和融合切開兩個子代細(xì)胞，在細(xì)胞的胞質(zhì)分裂中起著重要作用[5]。除胸腺和睪丸外，正常組織幾乎不能檢測到其表達(dá)。CEP55的過表達(dá)將造成細(xì)胞有絲分裂的缺陷，導(dǎo)致不穩(wěn)定的多核細(xì)胞出現(xiàn)，并增強細(xì)胞的遷移和侵襲能力[6]。最近的研究證實，在人結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌有著CEP55的高表達(dá)，而CEP55的異常表達(dá)與這些腫瘤的發(fā)生和不良預(yù)后密切相關(guān)[7-9]。目前尚未有研究報道人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CEP55表達(dá)情況及其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的具體作用。為此我們分析了不同級別膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中CEP55表達(dá)情況，并對CEP55在人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的作用做了初步研究。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

50例標(biāo)本均來源于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)標(biāo)本，獲得患者知情同意，均經(jīng)病理學(xué)證實。其中正常腦組織10例，Ⅰ級膠質(zhì)瘤組織7例，Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織13例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤組織10例，Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織10例(均按WHO分級標(biāo)準(zhǔn))。標(biāo)本收集后立即凍存于-80 ℃。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞由實驗室保存，含10%胎牛血清的Gibco高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

三、CEP55逆轉(zhuǎn)錄干擾病毒

CEP55干擾病毒購自中國上海吉凱基因公司(5'-GTGGGAAAGGAAAGCTGAC-3)。

四、主要試劑及儀器

Western Blot凝膠試劑盒(Beyotime公司)，CEP55一單抗(Abcam公司)，鼠和兔二抗(博士德公司)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(博士德公司)、濕轉(zhuǎn)儀為Bio Rad公司產(chǎn)品。熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)。CEP55基因PCR上游引物-TT GGAACAACAGATGCAGGC，下游引物-GAGTGCAG CAGTGGGACTTT；內(nèi)參(甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH)基因PCR上游引物-GAGCTACGAGCTGC CTGACG，下游引物-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG(美國Thermo Fisher公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR)試劑盒(日本Takara公司)。2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(CCK-8)試劑盒(日本同仁公司)，5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(edu)試劑盒(GeneCopoeia公司)。

五、q-PCR測定人正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織、U251細(xì)胞CEP55 mRNA表達(dá)

按照Trizol試劑盒說明書提取組織或細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，重復(fù)2次；將3次實驗獲得的各組cDNA進(jìn)行實時定量PCR檢測；PCR引物見前述，采用SYBR Premix PCR 試劑盒于熒光實時定量PCR儀CEP55的mRNA水平。

六、Western Blot檢測人正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織、U251細(xì)胞CEP55蛋白表達(dá)

蛋白提取試劑盒提取組織或細(xì)胞總蛋白，測定濃度后按常規(guī)方法進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，小鼠抗CEP55單抗標(biāo)記，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，增強化學(xué)發(fā)光顯影，以GAPDH為參照。

七、CEP55干擾載體逆轉(zhuǎn)率病毒感染U251細(xì)胞

取對數(shù)生長期U251細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，接種至25 mL培養(yǎng)瓶中。按病毒感染比率值10 ∶1取對照病毒和CEP55基因干擾病毒分別感染靶細(xì)胞，觀察細(xì)胞綠色熒光產(chǎn)生。感染72 h后，去除含病毒載體的培養(yǎng)液，洗滌后，加入新鮮含10%胎牛血清Gibco高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，供進(jìn)一步分析。

八、干擾組、對照組和空白組U251細(xì)胞增殖測定

按照干擾組為敲低CEP55的U251細(xì)胞，對照組為轉(zhuǎn)染陰性病毒U251細(xì)胞，空白組為未轉(zhuǎn)染病毒U251細(xì)胞分為3組，各組按照3個孔重復(fù)。CCK-8檢測：各組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，以3000個/孔接種于96孔板中，加培養(yǎng)液至0.1 mL，常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液，CCK-8細(xì)胞增殖分析試劑盒測定細(xì)胞增殖曲線。edu檢測：各組細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，按照每孔2×105/孔接種于6孔板內(nèi)，加培養(yǎng)液37 ℃過夜孵育后，每孔按照2 μL edu/1 mL培養(yǎng)液分別加入2 mL/孔混合液，37 ℃孵育6 h，按照試劑盒說明處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析。

九、流式細(xì)胞分析

采用凋亡試劑盒流式檢測，按試劑說明標(biāo)記各組人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，按照3個重復(fù)測定樣本，流式細(xì)胞分析儀檢測凋亡細(xì)胞比例。

十、統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學(xué)軟件分析，P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CEP55在人膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常腦組織

RT-PCR結(jié)果顯示，CEP55在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較正常腦組織明顯升高，無論是在低級別還是高級別皆增高(P<0.01)。但在低級別與高級別之間，CEP55的表達(dá)無顯著差異(P>0.05，圖1A)。Western Blot檢測結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果一致，CEP55蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)高于正常組織(P<0.01)，但并沒有隨膠質(zhì)瘤等級的提高而表達(dá)增高(P>0.05，圖1B、1C)。

二、干擾CEP55基因表達(dá)可抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖

用RNAi沉默U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞CEP55基因表達(dá)后，通過Western Blot和RT-PCR對抑制結(jié)果進(jìn)行驗證。Western Blot結(jié)果顯示干擾組CEP55表達(dá)顯著低于空白組和陰性對照組(圖2A)；RT-PCR結(jié)果顯示空白組、陰性對照組細(xì)胞CEP55 mRNA相對拷貝數(shù)無顯著差異(P>0.05)，而干擾組細(xì)胞CEP55 mRNA相對拷貝數(shù)顯著低于空白組和陰性對照組(P<0.01，圖2B)。

運用CCK-8比較干擾組、陰性對照組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在不同時間點的增殖情況，同時以單培養(yǎng)基作為空白對照，結(jié)果顯示：從第二天開始陰性對照組以及未轉(zhuǎn)染組增殖速率明顯快于干擾組；4 d后干擾組增殖曲線開始下降，而陰性對照以及未轉(zhuǎn)染組增殖正常。干擾組以及陰性對照組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明兩者之間有顯著差異(P<0.01，圖3A、3B)，說明抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞CEP55基因的表達(dá)、活化可抑制細(xì)胞增殖。

流式細(xì)胞術(shù)分析edu結(jié)果顯示干擾組增殖細(xì)胞比例顯著低于陰性對照組和空白組(P<0.01，圖3C)。再次證實了CEP55對U251細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

圖1 CEP55在膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)檢測

Fig 1 Expression of CEP55 in different grades of human glioma tissues and human normal brain tissues

A: Detection of CEP55 mRNA in variable grades of human glioma tissues and human normal brain tissues by RT-PCR analysis; B: Protein levels of CEP55 in GC and normal tissue samples determined by Western Blot; C: Statistical results of CEP55 expression by Western Blot.

aP<0.01,vsnormal group.

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染前后人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中CEP55表達(dá)的檢測

Fig 2 Expression of CEP55 in glioma cells U251 before and after siRNA transfection

A: mRNA expression of CEP55 measured by RT-PCR; B: Expression of CEP55 protein analyzed by Western Blot.

aP<0.01,vscontrol group.

圖3 CCK-8以及edu檢測CEP55對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的影響

Fig 3 Effect of CEP55 on the proliferation of glioma cells U251 detected by CCK-8 and edu

A: Seven-day proliferating curve of U251 cells after siRNA transfection by CCK-8; B: Statistical analysis of CCK-8 results among all groups; C: Proliferation of U251 cells measured by edu.

aP<0.01,vscontrol group.

三、抑制CEP55基因的表達(dá)促進(jìn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的凋亡

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示陰性對照組、空白組細(xì)胞凋亡率分別為12.8%、11.2%，干擾組凋亡率為35.0%，干擾組顯著高于空白組和陰性對照組(P<0.01，圖4)。說明抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞CEP55基因的表達(dá)及活化可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CEP55對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡的影響

Fig 4 Apoptosis of glioma cell line U251 was measured by flow cytometry

aP<0.01,vscontrol group.

討 論

中心體在正常細(xì)胞分裂中起重要作用，但如果多個中心體同時出現(xiàn)就會導(dǎo)致紡錘體形成的異常，從而影響細(xì)胞的分裂，導(dǎo)致染色體非整倍性的出現(xiàn)，這種現(xiàn)象常見于腫瘤的發(fā)生發(fā)展中[10-11]。中心體相關(guān)蛋白CEP55的異位表達(dá)或缺失都可導(dǎo)致中心體的異常，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。Tao等[6]發(fā)現(xiàn)，胃癌中CEP55表達(dá)顯著增高。Chen等[12]對肝細(xì)胞肝癌組織及癌旁組織中的CEP55的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)CEP55高表達(dá)的患者比不表達(dá)或低表達(dá)的患者預(yù)后更差。對于顱內(nèi)原發(fā)最常見的膠質(zhì)瘤是否存在CEP55的表達(dá)及表達(dá)水平尚不清楚。我們采用了RT-PCR和Western Blot方法分別檢測了不同級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織的CEP55表達(dá)情況。結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞CEP55表達(dá)顯著高于正常腦組織。但高級別和低級別膠質(zhì)瘤之間CEP55的表達(dá)沒有顯著差異。該結(jié)果提示CEP55可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，但與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性程度沒有一致性關(guān)系。

為了解其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，我們采用siRNA慢病毒載體干擾膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中CEP55表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞CEP55受抑制后，細(xì)胞的生長于第4天開始變慢，增殖速度顯著低于對照組。該結(jié)果提示CEP55在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。Liu等[13]在發(fā)現(xiàn)人肺癌組織高表達(dá)CEP55的基礎(chǔ)上抑制人肺癌A549、95D細(xì)胞株細(xì)胞CEP55的表達(dá)，細(xì)胞增殖顯著受抑。Wang等[7]通過抑制高表達(dá)CEP55的乳腺癌細(xì)胞也證實了CEP55的促增殖作用。以上結(jié)果提示CEP55促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖是高表達(dá)該基因腫瘤的共同特征。此外，在CEP55受抑制后的U251細(xì)胞不僅出現(xiàn)增殖變慢，細(xì)胞體積也變大，胞核輪廓模糊，并出現(xiàn)較多漂浮死亡細(xì)胞。我們采用流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示U251細(xì)胞在CEP55干擾下調(diào)后，細(xì)胞凋亡明顯增加，顯著高于對照組。該結(jié)果提示CEP55不僅參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖調(diào)控，而且與細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)機制相關(guān)。

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)CEP55在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增高，抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞CEP55基因的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其具體機制尚有待進(jìn)一步研究探索。

1SIEGEL R, MA J, ZOU Z, et al. Cancer statistics, 2014 [J]. CA Cancer J Clin , 2014, 64(1): 9-29.

2《中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷和治療指南》編寫組. 中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南(2015) [J]. 醫(yī)學(xué)雜志，2016, 96(7): 485-509.

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ExpressionofCEP55inhumangliomaanditseffectontheproliferationandapoptosisofgliomacelllineU251

ZHUHongfan1,CHENDiangang1,LVShengqing2,TANGJinliang3,WANGDonglin4,LIGuanghui1

1CancerResearchInstituteofPLA;2DepartmentofNeurosurgery;3DepartmentofPathology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037;4DepartmentofOncology,CancerHospitalofChongqing,Chongqing400030, China

ObjectiveThe expression of centrosomal protein 55 (CEP55) in human glioma cells was detected and the effect of CEP55 on proliferation and apoptosis of human glioma cell line U251 cells was analyzed.MethodsThe expression of CEP55 was measured by quantitative real-time PCR and Western Blot in 40 human glioma tissues of variable grades and 10 normal brain tissues. The proliferation of glioma cell line U251 was measured by CCK-8 kits and edu kits and the apoptosis of glioma cell line U251 was measured by flow cytometry after CEP55 silencing.ResultsThe expression of CEP55 was increased significantly in 40 glioma tissues compared to 10 normal brain tissues (P<0.01). However, there was no statistical difference in the expression of CEP55 between patients with high grade glioma and lower grade glioma (P>0.05). The proliferation of U251 cells was inhibited markedly after CEP55 knockdown by RNAi (P<0.01); the apoptosis of U251 cells was profoundly increased after CEP55 knockdown (P<0.01).ConclusionThe expression of CEP55 is significantly increased in human glioma cells compared with normal brain tissue; the overexpression of CEP55 promotes the proliferation of glioma U251 cells and inhibits the apoptosis of U251 cells.

CEP55; Glioma; U251 cells; Proliferation; Apoptosis

1671-2897(2017)16-197-05

朱虹帆，住院醫(yī)師，E-mail: garnett00@21cn.com

*通訊作者： 李光輝，副教授、副主任醫(yī)師，E-mail: liguanghui_2000@aliyun.com

R 739.41

A

2016-11-15；

2017-01-05)