李鵬起 李秉琴 閆志豐 陳曉燕 袁亮 董秋峰 楊鑫 李三中 甄海寧 費舟

(1第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710032; 2海東市樂都區(qū)人民醫(yī)院婦產科，青海 海東 810700)

·腦膠質細胞瘤診治研究·

人巨細胞病毒蛋白pp65在膠質瘤中的表達及意義

李鵬起1李秉琴2閆志豐1陳曉燕1袁亮1董秋峰1楊鑫1李三中1*甄海寧1*費舟1

(1第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710032;2海東市樂都區(qū)人民醫(yī)院婦產科，青海 海東 810700)

目的探討人巨細胞病毒(HCMV)蛋白pp65在膠質瘤中的表達水平及其意義。方法采用免疫組化方法檢測HCMV蛋白pp65在175例人腦膠質瘤組織及10例正常人腦組織中的表達，分析其表達水平與膠質瘤臨床病理學特征的關系。結果pp65蛋白在膠質瘤組織中的表達水平明顯高于正常人腦組織(Z=-4.338,P=0.000)；pp65蛋白在高惡性度膠質瘤中的免疫染色強度明顯強于低惡性度膠質瘤(Z=-0.960,P=0.037)，而pp65蛋白免疫染色強度與膠質瘤的病理級別無明顯的相關性(r=0.096,P=0.208)，以及pp65蛋白免疫染色強度與膠質瘤患者的性別(r=0.138,P=0.069)、年齡(r=0.016,P=0.837)和腫瘤部位(r=-0.147,P=0.052)也均無明顯相關性。結論HCMV感染及其蛋白pp65表達可能與人腦膠質瘤的發(fā)生存在一定關系，但其確切的致瘤機制尚需進一步研究。

人巨細胞病毒; 磷酸化糖蛋白65; 膠質瘤; 免疫組化

膠質瘤是中樞神經系統發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占顱內腫瘤的45%。盡管在膠質瘤的影像診斷、手術治療、放射治療以及藥物治療方面取得了很大的進展，但膠質瘤患者的預后并未得到根本的改善，經規(guī)范的綜合治療后，目前惡性膠質瘤患者的中位生存期尚不足15個月。因此，需要對膠質瘤的病因學和發(fā)病機制進行更深入的研究，以期為臨床提供新的更為有效的治療策略。近年來有研究顯示在人膠質瘤以及其它類型的惡性腫瘤中存在人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)的感染及其病毒蛋白的表達，提示HCMV可能與人類某些惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在一定關系，但研究結果仍存在很大分歧[1-2]。基于此，本研究采用免疫組化方法檢測了HCMV磷酸化糖蛋白65(phosphorylated glycoprotein 65, pp65)在人腦膠質瘤組織中的表達水平，并進一步分析了pp65蛋白表達水平與膠質瘤臨床病理學特征的關系。

材料與方法

一、病例和標本

175例膠質瘤組織均取自西京醫(yī)院神經外科手術切除的腫瘤標本，10例正常人腦組織為該科室在腦外傷內減壓術或高血壓腦出血皮層造瘺術中獲得。本組膠質瘤患者男性102例，女性73例；年齡2～81歲，平均(40.1±16.8)歲；腫瘤位于幕上150例，幕下25例。膠質瘤標本均經福爾馬林固定、石蠟包埋，由西京醫(yī)院病理科行HE染色及相關腫瘤標志物免疫組化染色，按照2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類和分級標準進行確診，其中Ⅰ級25例，包括毛細胞型星形細胞瘤13例、節(jié)細胞膠質瘤12例；Ⅱ級50例，包括彌漫型星形細胞瘤25例、原漿型星形細胞瘤1例、肥胖型星形細胞瘤1例、少突膠質細胞瘤7例、少突星形細胞瘤11例、室管膜瘤4例、脊索樣膠質瘤1例；Ⅲ級47例，包括間變型星形細胞瘤12例、間變型少突膠質細胞瘤21例、間變型少突星形細胞瘤12例、間變型節(jié)細胞膠質瘤2例；Ⅳ級53例，包括膠質母細胞瘤42例、巨細胞膠質母細胞瘤1例、膠質肉瘤1例、髓母細胞瘤6例、原始神經外胚層腫瘤3例。低惡性度膠質瘤(包括Ⅰ級和Ⅱ級)75例，高惡性度膠質瘤(包括Ⅲ級和Ⅳ級)100例(表1)。

二、免疫組化方法

采用聚合物-過氧化物酶(polymer-peroxidase, PP)免疫組化兩步法。膠質瘤組織蠟塊連續(xù)切片，厚3 μm，貼于涂有3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane, APES)防脫片膠的載玻片，60 ℃烤片8 h后備用。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，浸于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)緩沖液(pH=9.0)中高壓熱修復2 min 15 s。切片用3% H2O2于室溫下孵育10 min，以封閉內源性過氧化物酶活性。用動物血清工作液于室溫下孵育1 h，以封閉非特異性結合位點。HCMV pp65一抗(英國Leica公司)稀釋度為1 ∶50，4 ℃冰箱孵育過夜(12～18 h)。EnVision復合物液(丹麥Dako公司)于室溫下孵育30 min。二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色，蘇木素復染。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。以HCMV蛋白pp65表達陽性的結腸癌組織切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)代替一抗作為陰性對照。

三、結果判定

HCMV蛋白pp65免疫組化染色強度根據陽性細胞百分率和著色程度兩個方面綜合評定為-～+++。每例標本在瘤細胞免疫反應較強的區(qū)域，于×400高倍鏡下隨機選取3～5個視野，共計數1000個細胞。陽性細胞百分率評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，> 50%為3分。著色程度評分：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色或棕褐色為3分。兩者之乘積為切片的染色分值，以此評定染色強度：-(0分)，+(1、2分)，++(3、4分)，+++(6、9分)。

四、統計學分析

采用SPSS 19.0軟件包進行統計學分析，HCMV蛋白pp65表達水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理級別的關系采用Spearman等級相關分析；pp65蛋白表達水平在膠質瘤與正常人腦組織，高、低不同惡性程度膠質瘤之間的差異采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、HCMV蛋白pp65在膠質瘤和正常人腦組織中的表達

pp65蛋白免疫反應信號定位于胞核和/或胞漿，以胞核為主(圖1)。pp65蛋白在175例膠質瘤組織中有138例呈現陽性表達，陽性表達率78.9%；而在10例正常人腦組織中均無表達；pp65蛋白在膠質瘤組織中的表達水平明顯高于正常人腦組織(Z=-4.338,P=0.000)。

二、HCMV蛋白pp65表達與膠質瘤臨床病理學特征的關系

pp65蛋白在高惡性度膠質瘤中的免疫染色強度明顯強與低惡性度膠質瘤(Z=-0.960,P=0.037)，而pp65蛋白免疫染色強度與膠質瘤的病理級別無明顯的相關性(r=0.096,P=0.208)，以及pp65蛋白免疫染色強度與膠質瘤患者的性別(r=0.138,P=0.069)、年齡(r=0.016,P=0.837)和腫瘤部位(r=-0.147,P=0.052)也均無明顯相關性(表1)。

圖1 HCMV蛋白pp65在人膠質瘤中的表達(免疫組化，DAB顯色，×400)

Fig 1 Expression of pp65 protein of human cytomegalovirus in human brain gliomas (Immunohistochemistry, DAB coloration, ×400)

A: Pilocytic astrocytoma (WHO Grade I) with moderate expression of protein pp65 (Graded ++); B: Diffuse astrocytoma (WHO Grade Ⅱ) with low expression of protein pp65 (Graded +); C: Anaplastic oligodendroglioma (WHO Grade III) with strong expression of protein pp65 (Graded +++); D: Glioblastoma (WHO Grade IV) with strong expression of protein pp65 (Graded +++); E: Normal human brain tissue with negative expression of protein pp65; F: Anaplastic oligodendroglioma (WHO Grade Ⅲ) with negative expression of protein pp65 (negative control, the same specimen as shown in Picture C).

表1 HCMV蛋白pp65表達與膠質瘤臨床病理學特征的關系 (n, %)

Tab 1 The relationship between pp65 expression of HCMV and clinicopathological features of gliomas (n, %)

Clinicopathologicalfea-turesnpp65-++++++Positiveexpressionrates(%) Gender Male1022527203075.5 Female731214192883.6 Age(yearsold) 0～2026755973.1 21～4052131272075.0 41～60801320242380.7 >6017443676.5 Tumorlocation Supratentorialarea1503132325579.3 Infratentorialarea25697376.0 Pathologicalfeature WHOⅠ25736972.0 WHOⅡ50121581576.0 WHOⅢ471210111474.5 WHOⅣ53613142088.7 Benignormalignant Benigngliomas751918142474.7 Malignantgliomas1001823253482.0 Total1753741395878.9

討 論

HCMV屬于皰疹病毒β亞科，是人類皰疹病毒組中最大的一種病毒。HCMV基因結構為雙鏈線狀DNA，全長約235 kb，整個基因組編碼約165種蛋白[3]。pp65蛋白是由HCMV基因UL83編碼的一種被膜蛋白，屬于低基質磷酸化蛋白，具有高度的保守性，含有561個氨基酸，分子質量65 kD。pp65是HCMV感染后發(fā)生細胞免疫反應的主要靶點之一，其與人體免疫系統相關分子結合，可阻止HCMV感染的細胞被人體免疫系統相關分子攻擊，具有免疫逃避功能[4]。HCMV在人群中的感染非常普遍，根據不同國家和地區(qū)其感染率可達70%～100%。HCMV在通常情況下呈隱性感染，但在免疫功能低下的人群(如艾滋病、器官移植和惡性腫瘤等患者)中可引起嚴重疾病。此外，有研究顯示HCMV感染及其相關蛋白具有致瘤可能，相關機制涉及腫瘤細胞的存活、增殖、凋亡、侵襲、血管生成、細胞周期調控和信號轉導通路改變等[5-6]。

2002年，Cobbs等[7]首先報道了HCMV在人腦膠質瘤組織中存在很高的感染率，而在正常人腦組織及腦膜瘤等良性腫瘤中則無HCMV感染。作者采用免疫組化方法檢測27例WHO Ⅱ～Ⅳ級膠質瘤標本中HCMV蛋白IE1-72的表達，結果顯示在所有被檢測的膠質瘤組織中均有IE1-72蛋白的表達；對其中10例膠質瘤標本檢測了HCMV蛋白pp65的表達，結果也均有pp65蛋白的陽性表達，作者認為HCMV感染與人腦膠質瘤的發(fā)生可能存在密切關系。2008年，Mitchell等[8]采用免疫組化方法在30/33例膠質母細胞瘤中檢測到pp65蛋白的表達，陽性表達率高達91%，再次提示在人膠質瘤組織中存在HCMV的感染，并與膠質瘤的發(fā)生可能有關。Shamran等[9]的研究也取得了類似的結果。與以上研究報道相對應，也存在許多相反的研究結果。Lau等[10]采用免疫組化方法檢測22例膠質瘤，包括3例彌漫型星形細胞瘤、3例室管膜瘤、2例少突膠質細胞瘤、6例間變型星形細胞瘤和8例膠質母細胞瘤，結果顯示在以上膠質瘤組織中均無pp65蛋白的表達以及HCMV感染的跡象。Poltermann等[11]的研究同樣也認為在人腦膠質瘤組織中并無HCMV感染的證據。Baumgarten等[12]采用免疫組化方法檢測123例腦腫瘤標本，包括91例膠質母細胞瘤、20例髓母細胞瘤和12例神經母細胞瘤，結果顯示pp65蛋白僅在1例膠質母細胞瘤中呈弱陽性表達?？梢?，關于在膠質瘤組織中是否存在HCMV感染及其蛋白表達仍存在嚴重分歧，其原因可能與腫瘤標本的選擇、檢測方法的不同以及不同地區(qū)和種族HCMV感染的水平存在差異有關。

國內學者Ding等[13]和Xing等[14]分別采用免疫組化方法檢測67例和79例腦膠質瘤標本，結果顯示pp65蛋白在腦膠質瘤組織中均有很高的陽性表達率。本研究采用免疫組化方法檢測175例腦膠質瘤標本，這是目前國內外最大宗的一組研究資料，結果顯示pp65蛋白在腦膠質瘤組織中陽性表達率為78.9%，而在正常人腦組織中均無表達，pp65蛋白在腦膠質瘤中的表達水平明顯高于正常人腦組織，提示HCMV感染及其pp65蛋白表達與腦膠質瘤的發(fā)生存在一定關系。Ding等[13]的研究結果顯示pp65蛋白的表達陽性率在膠質瘤的病理級別間無明顯差異，而Xing等[14]的研究結果顯示在高級別膠質瘤中pp65蛋白的表達陽性率要高于低級別膠質瘤。本研究結果顯示pp65蛋白在高惡性度膠質瘤中的免疫強度明顯強于低惡性度膠質瘤，而pp65蛋白免疫染色強度在膠質瘤不同病理級別間無統計學顯著差異(表1)。以上研究結果之間的差異可能與膠質瘤組織標本的選擇以及具體的免疫組化方法的不同有一定關系，此外也尚不能完全排除pp65蛋白在膠質瘤發(fā)展和演進過程中發(fā)揮一定的作用。本研究結果還顯示pp65蛋白的表達水平與膠質瘤患者的性別、年齡和腫瘤生長部位均無明顯的相關性，提示膠質瘤患者不同的性別、年齡和膠質瘤發(fā)生部位有著相似的HCMV感染幾率。

總之，本研究結果顯示HCMV感染及其pp65蛋白表達與國人腦膠質瘤的形成可能存在一定的病因學關系，但其確切的致瘤作用機制尚需進一步深入研究。

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Expressionandsignificanceofpp65proteinofhumancytomegalovirusingliomas

LIPengqi1,LIBingqin2,YANZhifeng1,CHENXiaoyan1,YUANLiang1,DONGQiufeng1,YANGXin1,LISanzhong1,ZHENHaining1,FEIZhou1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;2DepartmentofGynecologyandObstetrics,LeduDistrictPeople'sHospitalofHaidongCity,Haidong810700, China

ObjectiveThe expression and significance of pp65 protein of human cytomegalovirus (HCMV) in gliomas were investigated.MethodsThe expression of pp65 protein of HCMV was detected by immunohistochemistry in 175 cases of human brain glioma and 10 cases of normal human brain tissue, as well as the relationship between its expression and clinicopathological features of gliomas was further analyzed.ResultsExpression of pp65 protein in gliomas was significantly higher than that in normal human brain tissues (Z=-4.338,P=0.000). Immunostaining intensity of pp65 protein in malignant gliomas was significantly higher than that in benign gliomas (Z=-0.960,P=0.037), while the immunostaining intensity of pp65 protein was not significantly associated with the pathological grade (r=0.096,P=0.208), as well as with the gender (r=0.138,P=0.069), age (r=0.016,P=0.837) and tumor site (r=-0.147,P=0.052) of glioma patients.ConclusionHCMV infection and its protein pp65 expression may be associated with the tumorigenesis of human brain gliomas, however its exact oncogenous mechanism needs further study.

Human cytomegalovirus (HCMV); Pp65; Glioma; Immunohistochemistry

1671-2897(2017)16-202-05

陜西省社會發(fā)展攻關計劃基金資助項目(2014K11-01-02-07)；西京醫(yī)院學科助推計劃創(chuàng)新人才基金資助項目(XJZT08R09)

李鵬起，碩士研究生，住院醫(yī)師，E-mail: wwwqinghailpq@sina.com

*通訊作者： 李三中，副主任醫(yī)師，E-mail: sunny_3c@126.com；甄海寧，副教授、副主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail: zhenhn@fmmu.edu.cn

R 373; R 739.41

A

2016-10-07；

2016-11-25)