李欣，庹必光,文國容，金海，安家興，王乾興，謝睿

(1遵義醫(yī)學院細胞生物學教研室，貴州遵義563000；2貴州省消化病研究所；3遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

TGF-β對胃癌細胞干性因子Oct4、Nanog表達的影響及機制

李欣1,2，庹必光2，3,文國容2,3，金海2,3，安家興2,3，王乾興1，謝睿2,3

(1遵義醫(yī)學院細胞生物學教研室，貴州遵義563000；2貴州省消化病研究所；3遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

目的探討TGF-β對胃癌細胞干性因子Oct4、Nanog表達的影響。方法將培養(yǎng)的胃癌MKN45細胞分為對照組、TGF-β(10 ng/mL)組和TGF-β+BAPTA-AM組，對照組不進行任何處理，其余兩組分別采用相應(yīng)試劑刺激24 h。采用qRT-PCR、Western blotting技術(shù)檢測胃癌相關(guān)干性因子Nanog、Oct4的mRNA和蛋白表達水平。高速離子成像系統(tǒng)檢測加入正常的PSS液(空白對照組)、加入TGF-β(20 ng/mL)(單獨TGF-β組)及加入TGF-β+BAPTA-AM (聯(lián)合組)作用后胃癌細胞MKN45內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果與對照組比較，TGF-β組Nanog和Oct4 mRNA及蛋白的表達上調(diào)(P均<0.05)，與TGF-β組比較，TGF-β+BAPTA-AM組Nanog和Oct4 mRNA及蛋白的表達下調(diào)(P均<0.05)。與空白對照組比較，TGF-β組細胞內(nèi)鈣增加(P<0.05)；與單獨TGF-β組比較，聯(lián)合組細胞內(nèi)鈣減少(P<0.05)。結(jié)論TGF-β可能通過增加細胞內(nèi)鈣濃度而使胃癌細胞干性因子Oct4、Nanog的表達增強。

胃癌；轉(zhuǎn)化生長因子β； 腫瘤細胞干性因子；Nanog

胃癌是消化道最常見惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和病死率都極高。腫瘤干細胞是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的治療藥物不能殺死腫瘤干細胞。目前已知促進腫瘤細胞干性功能的基因主要有Oct4、Nanog和CD44等。轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)是公認的調(diào)節(jié)腫瘤干性的細胞因子[1]。TGF-β在多種消化道腫瘤如食管癌、胃癌、肝癌、大腸癌等的侵襲、轉(zhuǎn)移以及促進腫瘤的細胞生物學行為中發(fā)揮了重要作用。研究證實，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細胞內(nèi)鈣信號重構(gòu)被認為是促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲的關(guān)鍵事件。有文獻報道，在多種腫瘤干細胞和腫瘤細胞中，Ca2+參與調(diào)控腫瘤細胞的侵襲、遷移，而P物質(zhì)可以顯著升高胃癌細胞內(nèi)鈣離子濃度，進而作用于胃癌細胞，調(diào)控其發(fā)生發(fā)展[2,3]；并且細胞內(nèi)鈣信號活化和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞密切相關(guān)[4]。但是，目前有關(guān)TGF-β是否可以參與調(diào)控胃癌細胞內(nèi)鈣活化，進而影響胃癌細胞干性因子表達鮮有報道。2016年8月～2017年7月，本試驗進行了相關(guān)探討，為胃癌的發(fā)病機制提供相關(guān)理論基礎(chǔ)和研究線索。

1 材料與方法

1.1 材料及其來源 胃癌MKN45細胞株購自中科院上海細胞庫。人胃癌細胞系MKN45為貼壁生長的細胞，用含10%的牛血清、1%雙抗(含青霉素、鏈霉素)的MEM培養(yǎng)基于50 mL培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)。傳代時用已高壓滅菌過的PBS洗1～2次，用含0.25%的豬胰蛋白酶、0.02% EDTA、酚紅，不含鈣鎂離子的消化液對其進行消化，按1∶4的比例傳代，每隔2～3 d換液1次，5～7 d傳代1次。37 ℃、5% CO2條件下生長。試劑與藥品：MEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物公司，一抗(β-actin、Nanog、Oct4)和二抗辣根過氧化物酶標記(山羊抗兔)購自美國Abcam公司，BAPTA-AM購自美國Sigma公司，TGF-β購自美國Sigma公司，F(xiàn)lua-2鈣熒光染料購自美國Invitrogen公司， ECL發(fā)光劑Western blotting Substract Reagent購自上海復(fù)泰生物公司。實驗儀器：高速低溫冷凍離心機購自德國Eppendorff公司，全波段酶標儀購自美國Thermo公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，細胞培養(yǎng)超凈臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司，熒光定量PCR儀、ChemiDocTMTouch Imaging System 購自美國百樂公司。

1.2 細胞分組及處理 MKN45細胞隨機分為對照組、TGF-β組和TGF-β+BAPTA-AM組，對照組不進行任何處理,其余兩組分別用TGF-β(10 ng/mL)、 TGF-β(10 ng/mL)+BAPTA-AM(5 μmol/mL)作用24 h。

1.3 MKN45細胞中干性因子Nanog和Oct4 mRNA 表達的檢測 采用qRT-PCR法。按照TRAN說明書提取MKN45細胞總mRNA。采用Easy ScriptR One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)Primer Bank 進行引物設(shè)計，引物由上海生工公司合成。Nanog基因上游引物：5′- TCTTCCTAACAAGACAACTTTGG-3′，下游引物：5′-TTGTTCCAGGTCGGCCATCACGC-3′；Oct4基因上游引物：5′-TATTCAGCCAAACGACCATCT-3′，下游引物：5′-TTGTTCCAGGTCGGCC ATCACGC-3′；GAPDH基因上游引物：5′-TATCGTGGAAGGCCTAT-3′，下游引物：5′-CACAGTTTCGGCATTCT-3′。使用TipGreen qPCR SuperMix 擴增試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40～45 個循環(huán)。每次反應(yīng)過程結(jié)束均進行溶解曲線、溶解峰和擴增曲線的分析，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.4 MKN45細胞中干性因子Nanog和Oct4蛋白表達的檢測 采用Western blotting法。收集MKN45細胞置于1.5 mL EP管中，加入4 ℃已預(yù)冷的RIPA裂解液1 mL，離心(4 ℃，12 000 r/min，30 min),根據(jù)BCA試劑盒測蛋白濃度。95 ℃，蛋白變性5 min,以十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳80 V分離蛋白30 min，然后110 V繼續(xù)分離蛋白約30 min。采用半干轉(zhuǎn)儀器轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1.5 h，然后孵育一抗(β-actin 1∶3 000，Nanog 1∶1 000，Oct4 1∶1 000 )，4 ℃搖床過夜。于次日，30 min復(fù)溫后，TBST洗3次，每次10～15 min。二抗山羊抗兔(1∶5 000)常溫搖床孵育1 h后，再次洗膜，同前述。ECL發(fā)光劑按說明書操作，以ChemiDocTMTouch Imaging System 進行曝光后β-actin為內(nèi)參，用Image Lab軟件分析對照組和實驗組蛋白條帶的灰度值,并計算目的蛋白的相對表達量。

1.5 MKN45細胞內(nèi)鈣濃度的測定 采用高速離子成像系統(tǒng)。將消化好的MKN45細胞以2×104/mL接種密度接種于24 mm×24 mm的載玻片上，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h待貼壁，至生長狀態(tài)良好。按說明書配制Fura-2鈣熒光染料和PSS液(pH 7.4)。取出培養(yǎng)好的細胞，以Fura-2鈣熒光染料室溫避光孵育1 h。上機觀察：打開灌流系統(tǒng)，在0～200 s給予正常的PSS液(空白對照組)待鈣熒光基線平穩(wěn)后，關(guān)閉灌流系統(tǒng)，給予細胞TGF-β(20 ng/mL)(單獨TGF-β組)預(yù)孵100 s后，開啟灌流系統(tǒng)，在200～400 s持續(xù)動態(tài)刺激，觀察單獨TGF-β組刺激后胃癌MKN45細胞內(nèi)鈣濃度(即細胞作用強度)的變化。在400～600 s的時間范圍內(nèi)給予TGF-β和BAPTA-AM(5 μmol/mL)共同刺激胃癌MKN45細胞(聯(lián)合組)，刺激方法與單獨TGF-β組方法相同。結(jié)果以GraphPad 5.0 軟件分析對照組與實驗刺激組的細胞作用強度的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 各組干性因子Nanog、Oct4 mRNA及蛋白表達比較 見表1。

表1 各組干性因子Nanog、Oct4 mRNA及蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與TGF-β組比較，#P<0.01。

2.2 各組細胞內(nèi)鈣濃度的變化 空白對照組胃癌MKN4細胞無明顯反應(yīng)，作用強度平均在1.561；單獨TGF-β組細胞內(nèi)鈣濃度瞬時升高，作用強度平均在4.631；聯(lián)合組細胞內(nèi)鈣無明顯反應(yīng)，作用強度平均在0.034。與空白對照組及聯(lián)合組比較，單獨TGF-β組細胞內(nèi)鈣濃度升高 (P均<0.05)，其余兩組間比較，P>0.05。

3 討論

胃癌腫瘤干細胞的存在是胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)鍵。腫瘤干細胞是腫瘤組織中存在的一小部分具有干細胞性質(zhì)的細胞群體，具有無限自我更新能力和多向分化的潛能。在腫瘤進展期，腫瘤干細胞一旦被激活，則可通過促進腫瘤血管生成和腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。成熟腫瘤的逆分化是導致腫瘤細胞侵襲、遷移的又一個可能的來源。研究證實，一些因素可以參與調(diào)控腫瘤干細胞的生理功能，例如，腫瘤細胞微環(huán)境、炎癥因子、細胞因子、細胞內(nèi)外pH、腫瘤壞死因子、生長因子等，而細胞因子中的TGF-β尤為重要[5]。研究證實，TGF-β在腫瘤細胞的生長、分化及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮越來越重要的作用。TGF-β與其特異性的受體結(jié)合后可以激活細胞內(nèi)多種信號分子[6]，進而促進相關(guān)細胞的生物學行為。近年，研究者們發(fā)現(xiàn)在肺癌和食管癌細胞，TGF-β可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及干性相關(guān)因子如Oct4、Nanog、Sox2 和 CD133的表達增加，促進腫瘤干細胞的成球成瘤能力，進而促進肺癌和食管癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[7，8]。Cheng等[9]研究顯示，SOC型鈣通道參與了TGF-β誘導的腫瘤干細胞的形成。

Nanog和Oct4是干細胞核心干性轉(zhuǎn)錄因子[10]，具有自我更新和多能性，在調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲、腫瘤干性以及腫瘤免疫逃避等方面發(fā)揮了重要作用[11，12]。Ho等[13]研究表明，在乳腺癌、大腸癌等腫瘤細胞中Nanog的過表達可以誘導黏著斑激酶(FAK)的表達，而在Nanog的siRNA沉默后可減少FAK的表達，抑制腫瘤的生長和進展，而Nanog的過表達可以增強細胞的侵襲程度。Nanog、Oct4、Sox2可作用于腫瘤干細胞并影響Wnt信號通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞中，TGF-β可以誘導胃癌干性因子Nanog、Oct4 mRNA和蛋白的表達增加。提示TGF-β可以調(diào)控胃癌的干性，并在此過程中發(fā)揮了重要作用。

Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第二信使和離子通道，參與調(diào)控了體內(nèi)重要的生命活動。細胞內(nèi)鈣的增高主要有兩種來源：細胞外鈣的內(nèi)流和細胞內(nèi)鈣的釋放。對于膜上的鈣通道有多種，如SOC型鈣通道、VGCC鈣通道、磷脂酶C通道等。這些鈣通道具有選擇性和開放性的特點，在某些特定的條件下發(fā)揮不同的作用。既往研究報道，TGF-β通過激活細胞內(nèi)的鈣依賴PKC途徑誘導胰腺癌細胞中10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物的減少進而參與了促進胰腺癌細胞侵襲[14]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β刺激胃癌細胞后可以使胃癌細胞內(nèi)鈣濃度升高，提示TGF-β誘導胃癌細胞干性因子表達可以通過促進胃癌細胞內(nèi)鈣信號活化來實現(xiàn)。

綜上所述，TGF-β促進細胞內(nèi)鈣的增加從而促進胃癌細胞干性因子Nanog、Oct4的表達上調(diào)，這為腫瘤的治療和開發(fā)抗腫瘤藥物提供了線索，具有廣闊的前景。但除此之外，是否還有其他作用機制的參與，目前尚不清楚，需要進一步研究證實。

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EffectsofTGF-βonexpressionofgastriccancerstemgenesOct4andNanog

LIXin1,TUOBiguang,WENGuorong,JINHai,ANJiaxing,WANGQianxing,XIERui

( 1DepartmentofCellBiology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

ObjectiveTo investigate the influence of transforming growth factor-β (TGF-β) on the expression of gastric cancer stem genes Oct4 and Nanog in gastric cancer cells.MethodsThe cultured gastric cancer cells MKN45 were divided into the control group, TGF-β (10 ng/mL) group, and TGF-β+BAPTA-AM group. The control group was not treated and the other two groups were stimulated with the corresponding reagent for 24 h. The mRNA and protein expression levels of Nanog and Oct4 were detected by qRT-PCR and Western blotting. High-speed ion imaging system was used to examine the changes of intracellular Ca2+concentrations in gastric cancer MKN45 cells with normal PSS solution (control group), TGF-β (20 ng/ml) (TGF-β group) and intracellular calcium chelator BAPTA-AM (BAPTA-AM group).ResultsCompared with the control group, the mRNA and protein expression levels of Nanog and Oct4 in the TGF-β group were up-regulated (bothP<0.05); compared with the TGF-β group, the mRNA and protein expression levels of Nanog and Oct4 in the TGF-β+ BAPTA-AM group were down-regulated (bothP<0.05). Compared with the control group, the intracellular calcium increased in the TGF-β group (P<0.05); compared with the TGF-β group, the intracellular calcium decreased in the BAPTA-AM group (P<0.05).ConclusionTGF-β could enhance the expression of cancer stem genes Oct4 and Nanog in gastric cancer cells by increasing the intracellular calcium concentration.

gastric carcinoma; transforming growth factor-β; cytokines of tumor cells; Nanog; Oct4

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.002

R735.2

A

1002-266X(2017)45-0005-04

國家自然科學基金資助項目(81660412)；遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院博士科研啟動基金[院字(2015)08號]。

李欣(1990-)，女，碩士研究生，主要從事消化系統(tǒng)惡性腫瘤的研究。E-mail：18786221478@163.com

王乾興(1974-)，男，碩士研究生導師，主要從事惡性腫瘤的研究。E-mail：317002641@qq.com；謝睿(1984-)，女，碩士研究生導師，主要從事消化系惡性腫瘤的研究。E-mail： xr19841029@aliyun.com

2017-09-10)