劉揚，盧斌，趙紅衛(wèi)

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院·宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌 443000)

半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇對急性脊髓損傷的保護作用及機制

劉揚，盧斌，趙紅衛(wèi)

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院·宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌 443000)

目的探討半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇對急性脊髓損傷的保護作用及機制。方法60只無特殊病原菌的雄性SD大鼠，隨機均分為A、B、C、D、E組。通過Allen′s法打擊進行脊髓造模。A組腹腔注射半乳糖凝集素-1 4 mg/kg聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇0.4 mg/kg，1次/d,持續(xù)1周；B組腹腔注射半乳糖凝集素-1 4 mg/kg，1次/d，持續(xù)1周；C組腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇0.4 mg/kg，1次/d,持續(xù)1周；D組腹腔注射甲基強的松龍30 mg/kg,12 h后再重復(fù)1次，以后1次/d，重復(fù)3 d；E組腹腔注射生理鹽水3 mg/kg，1次/d，持續(xù)1周。分別于術(shù)后1、3、7、14 d對各組大鼠進行行為學評價(BBB評分+斜板傾斜度)；于術(shù)后14 d行病變脊髓組織蘇木精-伊紅染色法及免疫組化染色檢查，同時用ELISA法測定IL-10及TNF-α表達水平。結(jié)果術(shù)后7、14 d，A組BBB評分及斜板傾斜度較其余組高(P均<0.05)；其中B、C、D組間比較，P均>0.05。術(shù)后14 d的HE染色結(jié)果顯示A組的脊髓組織神經(jīng)元數(shù)量多于其余組(P均<0.05)。免疫組化染色結(jié)果提示，A組脊髓組織的GAP-43陽性表達水平較其余組高(P均<0.05)。術(shù)后7 d及14 d ，與其余組比較，A組TNF-α表達水平低，IL-10水平高(P均<0.05)，而B、C、D組間比較，P均>0.05。結(jié)論半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇可減輕急性脊髓損傷的進一步損害，其作用機制可能與上調(diào)IL-10及下調(diào)TNF-α的表達水平有關(guān) 。

急性脊髓損傷；半乳糖凝集素-1；雷公藤內(nèi)酯醇；甲基強的松龍；大鼠

急性脊髓損傷(ASCI)的治療，除及時有效地行脊髓減壓手術(shù)外，藥物亦是ASCI治療與康復(fù)過程中的又一重要舉措。治療ASCI的經(jīng)典藥物甲強龍(MP)及神經(jīng)節(jié)苷脂臨床療效被提出質(zhì)疑，已經(jīng)不再作為治療ASCI的指南性用藥[1]，僅作為治療的選擇。目前學者普遍認為，藥物聯(lián)合療法在神經(jīng)修復(fù)過程中具有重要意義[2]。研究表明，半乳糖凝集素-1具有促進神經(jīng)生長、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗細胞凋亡及促進血管生成等作用[3]。雷公藤內(nèi)酯醇主要用于治療多種自身免疫性疾病，具有抗感染、免疫抑制等多種生物學活性[4]；另外，其對炎癥亦有直接的抑制作用，理論上可減輕ASCI中的繼發(fā)性損傷。目前上述兩種藥物聯(lián)合治療ASCI的研究未見報道，2017年6～8月，本文初步探討了半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇在大鼠ASCI中的保護作用，為臨床應(yīng)用治療ASCI提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠：三峽大學動物實驗中心提供，質(zhì)量250～300 g，符合國家醫(yī)用動物的使用標準；半乳糖凝集素-1蛋白：上海超研生物科技有限公司；雷公藤內(nèi)酯醇：大連輝瑞；TNF-α及IL-10的ELISA試劑盒均來自上海博谷生物科技有限公司；Allen′s打擊架：自行制備；切片機：德國MICROM公司；脫水機：德國Leica公司；包埋機：德國萊卡公司；顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)：德國萊卡公司；多功能熒光酶標儀：瑞士TECAN公司；MP、生理鹽水、其他試劑及儀器均由宜昌市中心人民醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 SD大鼠ASCI模型建立及分組 60只無特殊病原菌的SD大鼠，全部稱重后隨機均分為A、B、C、D、E組，各12只。大鼠麻醉：用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射后，通過摸肋骨的方法確定T10，逐層切開皮膚、筋膜、肌肉達T10棘突，小心咬除T10棘突及椎板后，依照Allen′s法[3]撞擊脊髓造模(重15 g的砝碼從10 cm處垂直落下撞擊墊片，當大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣擺動或軀體出現(xiàn)回縮抽動后, 則提示造模成功)。造模成功后立即給藥，各組大鼠給藥方式均采用腹腔注射，A組：給予半乳糖凝集素-1 4 mg/kg及雷公藤內(nèi)酯醇 0.4 mg/kg，1次/d，持續(xù)1周；B組：給予半乳糖凝集素-1 4 mg/kg，1次/d，持續(xù)1周；C組：給予雷公藤內(nèi)酯醇 0.4 mg/kg，1次/d，持續(xù)1周；D組：給予MP 30 mg/kg，12 h后再重復(fù)1次，以后1次/d，維持3 d；E組：給予生理鹽水3 mL/kg，1次/d，持續(xù)1周。術(shù)后應(yīng)用常規(guī)劑量抗生素預(yù)防感染，連續(xù)3 d；且下腹部按壓膀胱刺激大鼠排尿，3次/d，直至大鼠恢復(fù)自主排尿功能。

1.3 ASCI大鼠行為學評價 每組分別于術(shù)后1、3、7、14 d各取6只大鼠來評估大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)恢復(fù)情況。BBB評分[5]：把SD大鼠平放在操作臺上，觀察并記錄其后肢的運動情況，為了減少誤差，評分者為熟知BBB評分標準的非實驗人員；斜板試驗：將術(shù)后SD大鼠置于一塊有紋理的斜板上，使大鼠身體軸線與斜板縱軸保持一致，逐漸緩慢地抬高斜板一端，觀察并記錄大鼠停留在斜板上5 s時的最大傾斜角度，測量3次后取其均值。

1.4 ASCI大鼠的脊髓組織病理學變化觀察 采用HE染色及免疫組化染色。術(shù)后14 d神經(jīng)功能評定后進行麻醉，然后暴露心臟，左心室插管作為灌入道，剪開右心耳為其流出道，通過輸液器灌注溫生理鹽水500 mL，直至大鼠肝臟變白；然后用同樣的方法再灌注4%多聚甲醛溶液固定，待大鼠出現(xiàn)四肢抽搐、肢體變硬后更換體位，進行逐層暴露損傷處脊髓組織，取1 cm標本置于固定液中固定過夜，梯度脫水，石蠟包埋后4 μm切片,每個標本切6張，分別進行HE染色及GAP-43免疫組化染色，最后在400倍光學顯微鏡下觀察脊髓神經(jīng)組織形態(tài)學改變情況。

1.5 SCI大鼠血清中IL-10及TNF-α水平比較 各時間點取SD大鼠尾靜脈取血，進行IL-10及TNF-α表達檢測，操作步驟嚴格按照ELLSA說明書，加入相應(yīng)酶標試劑、顯示劑和終止液后測量各孔的光密度值并記錄。

2 結(jié)果

2.1 各組BBB評分及斜板傾斜度比較 術(shù)后7、14 d ，A組的BBB評分及斜板傾斜度較其余組高(P均<0.05)，而B、C、D組組間比較，P均>0.05。 詳見表1、2。

表1 各組術(shù)后各時點BBB評分比較(分，

注：與 A組同時點比較，*P<0.05。

表2 各組術(shù)后各時間點斜板傾斜度比較

注：與 A組同時點比較，*P<0.05。

2.2 各組神經(jīng)元細胞數(shù)及GAP-43陽性表達比較 術(shù)后14 d，各組損傷部位神經(jīng)元出現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕形成，胞質(zhì)細胞大量增生，大量的神經(jīng)元細胞數(shù)量減少，但是存活的神經(jīng)元包膜仍清晰可見。其中B、C、D組間病理表現(xiàn)無差異。術(shù)后14 d，神經(jīng)元細胞數(shù)：A、B、C、D、E組分別為(186±46)、(82±25)、(86±21)、(100±32)、(60±15)個/HP。A組神經(jīng)元數(shù)量多于其余各組(P均<0.05)，且A組組織結(jié)構(gòu)較其他組清晰。術(shù)后14 d ，GAP-43陽性表達的積累光密度值(IOD值)： A、B、C、D、E組分別為120±18、89±24、80±15、85±19、72±13。A組GAP-43陽性表達的IOD值高于其余組(P均<0.05)；B、C、D組間比較，P均>0.05。

2.3 各組術(shù)后各時點血清中IL-10、TNF-α水平比較 見表3、4。

表3 各組術(shù)后各時點血清IL-10水平比較

注：與A組同時點比較，*P<0.05。

3 討論

ASCI后所致的神經(jīng)損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，前者在受傷的當時就已經(jīng)決定且不可逆轉(zhuǎn)；而繼發(fā)性損傷發(fā)生在原發(fā)性損傷之后，是由缺血、水腫、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元壞死等多種機制所介導的可進一步損害受損的脊髓神經(jīng)組織[6]，因此臨床上采用藥物聯(lián)合多階段多方位地改善脊髓神經(jīng)組織的微環(huán)境，為修復(fù)ASCI創(chuàng)造更多有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的半乳糖凝集素-1是由神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞分泌，特別是星形膠質(zhì)細胞[7]。該蛋白在機體內(nèi)有多種存在形式，其中二聚體為該藥物的活性狀態(tài)，但其最終存在的形態(tài)取決于它的相對濃度和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不同組織的生化特征[8]。實驗表明，氧化態(tài)的半乳糖凝集素-1主要作用在于促進周圍神經(jīng)的突觸生長及軸突再生[9]。有文獻報道，半乳糖凝集素-1在ASCI中可能是通過吞噬作用、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進神經(jīng)膠質(zhì)增生及軸突再生等發(fā)揮保護作用[10]。亦有文獻報道，在脊髓損傷動物模型中發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞、小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞瞬時表達半乳糖凝集素-1[11]。這些論據(jù)間接闡述了半乳糖凝集素-1在脊髓損傷修復(fù)中扮演著重要角色。雷公藤內(nèi)酯醇是從雷公藤屬植物中提純得到的一種單體，目前臨床上主要用于治療急慢性腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾患。其主要是通過降低血管通透性、抑制炎癥細胞的趨化及產(chǎn)生、減輕血小板的聚集及炎癥后纖維增生等作用來發(fā)揮其臨床療效。該藥物在脊髓損傷中的研究較少，已有大量的研究證實了雷公藤內(nèi)酯醇可以抑制IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6[12]等因子，且能上調(diào)抑炎因子IL-10、TGF-β、IFN-β等表達[13]，理論上可以調(diào)控脊髓損傷后的微環(huán)境，促進脊髓損傷的恢復(fù)。據(jù)此推測半乳糖凝集素-1和雷公藤內(nèi)酯醇聯(lián)合使用治療ASCI具有協(xié)同作用，因此本實驗的宗旨是建立可靠的大鼠ASCI模型，觀察ASCI后半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠的保護作用。

表4 各組術(shù)后各時點血清TNF-α水平比較

注：與A組同時點比較，*P<0.05。

BBB評分隨病情好轉(zhuǎn)表現(xiàn)為逐漸升高的趨勢，可以較好地反映ASCI恢復(fù)的全過程，且符合其損傷的程度；斜板試驗用于辨別神經(jīng)功能的損傷程度，操作簡單且重復(fù)性好。本實驗結(jié)果表明，隨著術(shù)后時間的不斷延長，各組大鼠的后肢運動功能均有所改善，術(shù)后7 d及14 d，A組大鼠的BBB評分高于其他組，而其余3個藥物組間差異無統(tǒng)計學意義；表明半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇對SD大鼠SCI后的脊髓神經(jīng)功能具有保護作用，且療效優(yōu)于單獨使用及MP。

在ASCI發(fā)病過程中，錯綜復(fù)雜的免疫炎癥反應(yīng)常會加重脊髓損傷，導致脊髓組織進一步壞死，以及尚存的一些神經(jīng)細胞逐漸崩解促使損傷范圍逐漸加大。脊髓組織HE檢查顯示，傷后14 d，A組脊髓組織神經(jīng)細胞數(shù)多于其余各組，亦可觀察到A組大鼠脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)較其余3個藥物組清晰，這表明半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇可以減輕ASCI后脊髓神經(jīng)的損害，在組織病理學上優(yōu)于其他各藥物組。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中富含星形膠質(zhì)細胞，該細胞參與全身多種病理生理反應(yīng)。研究表明：它一方面限制了炎癥反應(yīng)；另一方面，它通過分泌硫酸軟骨素及蛋白多糖防止軸突細胞的再生，星形膠質(zhì)細胞增多有利于脊髓神經(jīng)損傷的修復(fù)[14]。本研究中，A組的星形膠質(zhì)細胞(GAP-43陽性表達)數(shù)高于其他藥物組。表明A組的脊髓神經(jīng)存活及再生多于其他各藥物組，提示半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇對ASCI后的大鼠脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)有促進作用。

IL-10是機體抑制炎癥反應(yīng)的細胞因子之一，國內(nèi)外已有大量文獻指明該因子的高表達有利于ASCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)[15]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后7 d及14 d，A組IL-10表達水平高于其余組，說明藥物聯(lián)合抑制炎癥反應(yīng)的效果較單獨使用及MP好。進一步表明半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇可能是通過增強IL-10的表達，從而發(fā)揮脊髓神經(jīng)的保護作用。TNF-α為體內(nèi)多種生物活性的促炎因子和創(chuàng)傷后反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，它可以在脊髓損傷局部部位迅速合成，在局部炎癥放大中具有重要意義。本研究結(jié)果表明，術(shù)后7 d及14 d，A組TNF-α表達水平低于其余組。提示半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇治療ASCI的作用機制之一可能是通過下調(diào)促炎因子TNF-α的表達水平。

綜上所述，半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇可減輕ASCI后繼發(fā)性損害，且其療效優(yōu)于單獨使用半乳糖凝集素-1或雷公藤內(nèi)酯醇。其作用機制可能是通過上調(diào)IL-10以及下調(diào)TNF-α表達水平來發(fā)揮脊髓神經(jīng)保護作用的，本研究為半乳糖凝集素-1聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇治療ASCI奠定了一定的理論基礎(chǔ)，擬為臨床治療ASCI提供一種新的思路。

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