陳霞，詹安娜，蔣麗萍

(吉安市婦幼保健院，江西吉安343000)

盆腔臟器脫垂患者主韌帶和宮骶韌帶組織中神經(jīng)肽Y、神經(jīng)肽Y受體的表達(dá)變化及意義

陳霞，詹安娜，蔣麗萍

(吉安市婦幼保健院，江西吉安343000)

盆腔臟器脫垂；神經(jīng)肽Y；神經(jīng)肽Y受體；主韌帶；宮骶韌帶

女性盆腔臟器脫垂是由各種原因?qū)е碌呐璧字С纸M織薄弱，造成盆腔器官下降移位引發(fā)器官的位置及功能異常；其以外陰部塊物脫出為主要癥狀，伴或不伴有排尿、排便異常，外陰部出血、炎癥等，不同程度地影響患者的生活質(zhì)量[1]。盆腔臟器脫垂可能是解剖、生理、遺傳、生活方式和分娩等眾多因素相互影響，并最終導(dǎo)致盆底功能障礙。有2/3的經(jīng)產(chǎn)婦在解剖學(xué)上有盆腔臟器脫垂跡象，但大部分婦女無(wú)癥狀[2～4]。研究認(rèn)為，神經(jīng)損傷、神經(jīng)遞質(zhì)減少或其他原因造成盆底血管改變，血流灌注不足，導(dǎo)致盆腔臟器相應(yīng)的結(jié)構(gòu)代謝改變和成分變化，從而發(fā)生盆腔臟器脫垂[5]。神經(jīng)肽Y是重要的血管活性肽，是由36個(gè)氨基酸組成的多肽，通過(guò)激活不同的受體發(fā)揮生物學(xué)作用。研究顯示，盆腔臟器脫垂患者肛提肌中神經(jīng)肽Y、血管活性腸肽和P物質(zhì)等肽能神經(jīng)顯著減少甚至缺失?？梢?jiàn)神經(jīng)肽Y在盆腔臟器脫垂的發(fā)病中可能起重要作用[6]。2015年10月～2017年4月，本研究對(duì)不同程度盆腔臟器脫垂患者不同部位神經(jīng)肽Y及其受體表達(dá)進(jìn)行觀察，并探討二者表達(dá)變化的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選盆腔臟器脫垂患者50例，均為子宮脫垂，均經(jīng)手術(shù)治療。患者年齡33～75(62.07±10.34)歲。按盆腔臟器脫垂定量評(píng)估體系(POP-Q)對(duì)盆腔臟器脫垂分度：Ⅰ度6例，Ⅱ度20例，Ⅲ度14例，Ⅳ度10例。將Ⅰ、Ⅱ度作為脫垂1組，Ⅲ、Ⅳ度作為脫垂2組。脫垂1組年齡34～75(60.07±8.85)歲；孕次(2.0±0.7)次，產(chǎn)次(1.9±0.4)次；BMI(23.7±2.4)kg/m2；脫垂2組年齡33～73(63.01±9.95)歲；孕次(2.5±0.9)次，產(chǎn)次(2.3±0.6)次；BMI(24.9±1.8)kg/m2。同期選擇宮頸癌患者30例作為對(duì)照組，均無(wú)盆腔臟器脫垂，均經(jīng)手術(shù)治療。年齡37～72(62.19±10.37)歲；孕次(2.2±0.6)次，產(chǎn)次(2.0±0.7)次；BMI(23.7±2.1)kg/m2?；颊呔鸦椋挥薪?jīng)陰道分娩史；近3個(gè)月內(nèi)無(wú)激素類藥物使用史；無(wú)其他結(jié)締組織疾病、雌激素相關(guān)性疾病、周圍神經(jīng)疾病及脊柱外傷史。三組年齡、孕次、產(chǎn)次及BMI有可比性。

1.2 組織標(biāo)本的提取及處理 三組均于術(shù)中切除主韌帶和宮骶韌帶組織標(biāo)本，于靠近子宮動(dòng)脈下方1 cm處取主韌帶組織，于韌帶與宮頸連接處以外0.5 cm處取宮骶韌帶。一部分經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，另外一部分放入Eppendorf管中保存。

1.3 主韌帶和宮骶韌帶組織神經(jīng)肽Y蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化法。將組織切片室溫下經(jīng)二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水脫蠟，3%過(guò)氧化氫浸泡10 min,PBS沖洗×3次×3 min，經(jīng)胃蛋白酶消化60 min,蒸餾水沖洗3 min,加血清、一抗，于4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗×3次×5 min，加二抗，37 ℃放置30 min，PBS沖洗×3次×5 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來(lái)水反藍(lán)30 min。常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化結(jié)果判斷：在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)抽取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。按細(xì)胞有無(wú)顯色或顯色深淺計(jì)分：無(wú)顯色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分；按顯色細(xì)胞比例計(jì)分：顯色細(xì)胞<1%計(jì)0分，1%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～100%計(jì)3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色深淺和陽(yáng)性細(xì)胞占組織細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)分，以兩者計(jì)分的乘積作為最終判斷標(biāo)準(zhǔn)：0為陰性；1～4為弱陽(yáng)性；6為陽(yáng)性；9為強(qiáng)陽(yáng)性；≥6為高表達(dá)，<6為低表達(dá)或不表達(dá)。

1.4 主韌帶和宮骶韌帶組織Y1受體、Y2受體mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用RT-PCR法。取出液氮標(biāo)本，每100 g組織中加入TRIzol 1 mL,提取總RNA。取RNA 1.25 μL經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性、3 min；94 ℃、40 s,退火40 s;72 ℃、40 s，35個(gè)循環(huán)。Y1受體退火溫度為52.5 ℃，Y2受體退火溫度為50.7 ℃。擴(kuò)增后72 ℃延伸7 min。實(shí)驗(yàn)用引物序列：Y1受體上游引物：5′-GGTCTTIGGTGAGGCGAT-3′，下游引物：5′-GCTGTGAGGTGGCAGAGC-3′；Y2受體上游引物：5′-CTGCTCCATCATCTTGCT-3′，下游引物：5′-CTGGCTGTCAATGTCAAC-3′；內(nèi)參上游引物：5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′，下游引物：5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′。通過(guò)凝膠成像分析軟件檢測(cè)神經(jīng)肽Y受體mRNA的表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量為神經(jīng)肽Y受體PCR灰度值/內(nèi)參PCR灰度值。

2 結(jié)果

2.2 各組主韌帶與宮骶韌帶組織中Y1受體、Y2受體 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組主韌帶與宮骶韌帶組織中神經(jīng)肽Y受體mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與脫垂1組比較，#P<0.05。

2.3 主韌帶與宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)與Y2受體mRNA表達(dá)的相關(guān)性 主韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)與Y2受體 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.479,P<0.05)，宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)與Y2受體 mRNA表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.173,P>0.05)。

3 討論

多層肌肉和筋膜組成女性盆底，盆底中有尿道、陰道和直腸穿出。子宮、膀胱、直腸等盆腔器官正常位置的保持有賴于盆底組織的支持。盆腔臟器脫垂的主要原因?yàn)榕璧准∪夂徒钅そM織的薄弱[7]。盆腔臟器脫垂的影響因素包括易感因素、誘發(fā)因素、促發(fā)因素、失代償因素，以上均可導(dǎo)致盆底支持薄弱。絕經(jīng)后的盆底組織退化性改變、陰道分娩損傷、有腹壓增高的疾病是盆腔臟器脫垂最常見(jiàn)的發(fā)病原因[8]。分娩過(guò)程中軟產(chǎn)道及其周圍的盆底組織擴(kuò)張，導(dǎo)致肌纖維拉長(zhǎng)、撕裂，損傷盆底神經(jīng)，尤其是產(chǎn)后過(guò)早參加體力勞動(dòng)，盆底組織張力恢復(fù)緩慢。目前隨著產(chǎn)科技術(shù)的提高，因?yàn)楫a(chǎn)傷造成的盆底功能障礙已明顯減少。隨著社會(huì)人口的老齡化，因?yàn)榻^經(jīng)后雌激素水平下降及盆底肌肉韌帶組織支持力下降，導(dǎo)致盆腔臟器脫垂成為中老年婦女的常見(jiàn)病，一定程度地影響婦女生活質(zhì)量[9]。根據(jù)發(fā)生部位，盆腔器官脫垂分為陰道前壁膨出、陰道后壁膨出、陰道頂脫垂、子宮脫垂、腸疝。部分患者同時(shí)存在多部位脫垂。輕度盆腔器官脫垂患者一般無(wú)不適，但是重度患者可有不同程度的腰骶部酸痛或下墜感、陰道塊狀物脫出、站立過(guò)久或勞累后癥狀明顯，可伴有排便、排尿困難。本研究對(duì)神經(jīng)肽Y及其受體在盆腔臟器脫垂患者主韌帶和宮骶韌帶組織的表達(dá)變化進(jìn)行觀察，以探討神經(jīng)肽Y及其受體在盆腔臟器脫垂發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床診治提供參考。

神經(jīng)肽Y是一種維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的激素，與應(yīng)激關(guān)系密切，廣泛存在于外周和中樞，在應(yīng)激引起的心血管疾病中起重要調(diào)節(jié)作用；在中樞有抗焦慮、癲癇，抑制生殖、肌肉興奮、交感興奮等作用，可使機(jī)體血壓、心率、代謝下降；可促進(jìn)食欲[10，11]；其外周主要作用是促進(jìn)血管平滑肌收縮和血管再生，對(duì)小動(dòng)脈有收縮作用，能參與生殖道局部血流的神經(jīng)調(diào)節(jié)。神經(jīng)肽Y受體屬于跨膜7次的G蛋白偶聯(lián)受體，目前發(fā)現(xiàn)在人體中有5種受體，其中Y1、Y2、Y4、Y5受體均已經(jīng)被克隆。Y1受體主要位于突觸后膜，分布于血管平滑肌，與血管收縮和血管平滑肌再生相關(guān)，Y2和Y5受體位于突觸前膜，抑制去甲腎上腺素的釋放，與血管生成及再生相關(guān)。Y4受體主要與進(jìn)食行為相關(guān)。神經(jīng)肽Y能上調(diào)自身受體表達(dá)。突觸后的受體Y1直接或間接地介導(dǎo)了血管收縮，其作用機(jī)制可能為增強(qiáng)去甲腎上腺素的作用及刺激平滑肌細(xì)胞增殖。Y1、Y5受體在粥樣斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Y2受體通過(guò)本身或與Y5受體協(xié)同作用促進(jìn)粥樣硬化斑塊的形成；二者可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移和毛細(xì)血管形成。除具有致粥樣斑塊形成的作用外，Y2受體還能抑制突觸前的去甲腎上腺素釋放[12]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組主韌帶、宮骶韌帶組織均有神經(jīng)肽Y及其Y1、Y2受體的表達(dá)。脫垂1、2組主韌帶與宮骶韌帶組織中神經(jīng)肽Y蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于對(duì)照組，說(shuō)明盆腔臟器脫垂患者主韌帶與宮骶韌帶組織中神經(jīng)肽Y蛋白呈低表達(dá)；脫垂2組主韌帶與宮骶韌帶組織中神經(jīng)肽Y蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于脫垂1組，說(shuō)明盆腔臟器脫垂越嚴(yán)重其主韌帶與宮骶韌帶組織中神經(jīng)肽Y蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越低?？梢?jiàn)，神經(jīng)肽Y可能參與盆腔臟器脫垂的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)RT-PCT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，脫垂2組主韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組及脫垂1組,而脫垂1組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；脫垂1、2組宮骶韌帶組織中Y2受體 mRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，脫垂1組宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，脫垂2組宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組。Y1受體在主韌帶、宮骶韌帶組織中表達(dá)升高，且盆腔臟器脫垂越嚴(yán)重表達(dá)越高，說(shuō)明Y1受體參與盆腔臟器脫垂發(fā)生發(fā)展。脫垂1、2組主韌帶與宮骶韌帶組織中Y2受體 mRNA表達(dá)有升高趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，脫垂1、2組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與本研究樣本小有關(guān)。主韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)與Y2受體 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，宮骶韌帶組織中Y1受體 mRNA表達(dá)與Y2受體 mRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性。說(shuō)明主韌帶組織中兩種受體可能協(xié)同參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，由于受體的作用復(fù)雜、交互，不能單一分析單個(gè)受體的影響。神經(jīng)肽Y系統(tǒng)只是韌帶中的一小部分，其變化對(duì)韌帶的改變及疾病的發(fā)生可能有作用，但也是有限的。

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陳霞(E-mail:yiyuan170815@163.com)

2017-08-16)