許云，高彤彤

(1南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南昌330003；2江蘇開放大學(xué))

口腔鱗狀細(xì)胞癌組織miRNA-222表達(dá)及其意義

許云1，高彤彤2

(1南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南昌330003；2江蘇開放大學(xué))

目的探討口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中微小RNA-222(miRNA-222)表達(dá)變化及其臨床意義。方法收集86例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織標(biāo)本為觀察組，30例口腔良性腫瘤患者的正?？谇火つそM織標(biāo)本為對照組。采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測兩組miRNA-222表達(dá)，分析口鱗狀細(xì)胞癌組織miRNA-222表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果觀察組、對照組miRNA-222相對表達(dá)量分別為2.854±0.172、0.765±0.113，兩組比較P<0.05。觀察組腫瘤直徑>3 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miRNA-222相對表達(dá)量分別高于腫瘤直徑≤3 cm、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織(P均<0.05)。結(jié)論口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miRNA-222表達(dá)升高，檢測miRNA-222表達(dá)變化有助于口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷和病情判斷。

口腔鱗狀細(xì)胞癌；微小RNA；微小RNA-222

口腔鱗狀細(xì)胞癌約占口腔癌的80%，具有發(fā)病率高、侵襲性高、患者預(yù)后差等特點(diǎn)[1～3]。微小RNA(miRNA)是一類單鏈小分子非編碼RNA，其可與靶基因序列通過互補(bǔ)配對的方式特異性結(jié)合，具有抑癌或促癌功能，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4,5]。miRNA-222是位于X染色體上miRNA家族成員之一，研究證實(shí)其參與了胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)病過程，并與患者預(yù)后密切相關(guān)[6,7]。目前，miRNA-222與口腔鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系尚不明確。本研究觀察了口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miRNA-222表達(dá)變化，并分析其與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年8月～2017年5月南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的86例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織標(biāo)本(觀察組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)為原發(fā)性口腔鱗狀細(xì)胞癌；②術(shù)前未接受過任何放、化療，也未接受過激素治療；③腫瘤原發(fā)灶保存良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期及哺乳期女性；②心功能不全；③肝、腎功能障礙；④其他類型惡性腫瘤?；颊吣?1例，女35例；年齡37～69(49.3±5.5)歲，其中<60歲56例，≥60歲30例；舌癌54例，頰癌32例；TNM臨床分期Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期47例；中高分化33例，低分化53例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。選取同期30例因良性腫瘤行手術(shù)切除患者的正常口腔黏膜組織為對照組，患者男19例、女11例，年齡38～69(48.0±5.9)歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 miRNA-222表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR法。采用組織miRNA快速提取試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)提取兩組標(biāo)本的總RNA，提取過程嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。采用紫外分光光度計對所得RNA濃度及純度進(jìn)行測定，A260/A280為1.8～2.1表明純度較好。采用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologies公司)合成cDNA?？偡磻?yīng)體系為25 μL，包括2 μL總RNA，1 μL 2.5 U/μL Poly A Polymerase，1 μL RTase Mix，5 μL 5XPAP/RT buffer，最后加入ddH2O定容至25 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。將得到的cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃環(huán)境中保存。miRNA-222引物上游序列為5′-CGCAGATCTTTTCT-TCCACAGA-3′，下游序列為5′-GGGGATCCTCTCAGGACACTGAAGC-3′，擴(kuò)增片段長度為155 bp。內(nèi)參為U6基因。U6引物上游序列為5′-CTCGCTTCGGAGCACA-3′，下游序列為5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA-3′，擴(kuò)增片段長度為96 bp。反應(yīng)體系為20 μL，其中包括10 μL 2× All-in-One qPCR Mix，2 μL Universal Adaptor PCR Primer，2 μL All-in-One miRNA qPCR Primer，2 μL cDNA，4 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s預(yù)變性，95 ℃ 3 s變性，80 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，變性至延伸這個過程共計循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt表示miRNA-222相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。分析口腔鱗狀細(xì)胞癌組織miRNA-222表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果

觀察組、對照組miRNA-222相對表達(dá)量分別為2.854±0.172、0.765±0.113，兩組比較P<0.05。腫瘤直徑>3 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織miRNA-222相對表達(dá)量分別高于腫瘤直徑≤3 cm、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織(P均<0.05)。見表1。

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織miRNA-222表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

口腔癌病情進(jìn)展迅速，早期即可轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)，晚期易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，局部切除聯(lián)合術(shù)后放、化療為其主要治療方法，但患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，5年生存率僅60%[8，9]。

miRNA是一類調(diào)控基因表達(dá)的單鏈小分子非編碼RNA，約為22個核苷酸，通過識別特定的mRNA并轉(zhuǎn)錄，可使靶mRNA降解，或者對其翻譯過程產(chǎn)生抑制作用，在基因的表達(dá)過程中發(fā)揮調(diào)控功能[10]。研究表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，miRNA具有抑癌或促癌基因的作用，其異常表達(dá)可參與信號激活、細(xì)胞增殖和分化、血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[11]。張竹青等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-222通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)參與肝癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程。韓福新等[12]報道，miRNA-21、miRNA-221、miRNA-222在腦膠質(zhì)瘤發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可作為腦膠質(zhì)瘤早期診斷和患者預(yù)后評估的重要指標(biāo)。姜訓(xùn)圳等[13]發(fā)現(xiàn)，miRNA-21、miRNA-135b、miRNA-141過高表達(dá)參與了結(jié)腸癌的發(fā)病過程，并且與腫瘤分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?？谇击[狀細(xì)胞癌組織中也存在不同程度的miRNA異常表達(dá)，這些miRNA參與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程。王遠(yuǎn)財?shù)萚2]研究證實(shí)，miRNA-149表達(dá)下調(diào)參與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病過程，并且與腫瘤的病理分級、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為評估口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床分期的腫瘤標(biāo)志物。此外，Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，miRNA-21表達(dá)越高，患者預(yù)后越差、術(shù)后5年生存率越低。

miRNA-222定位于染色體Xp11.3，作為促癌因子在肝細(xì)胞癌[15]、膀胱癌[16]等腫瘤組織中表達(dá)異常。本研究結(jié)果顯示，觀察組miRNA-222相對表達(dá)量高于對照組。提示miRNA-222表達(dá)上調(diào)可能參與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，可將其作為診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的輔助指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑>3 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀癌細(xì)胞組織中miRNA-222相對表達(dá)量相對較高。miRNA-222表達(dá)水平越高，口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性程度越高，同時也越容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后也越差。提示miRNA-222可作為評估口腔鱗狀細(xì)胞癌病情的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，miRNA-222在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)。miRNA-222可能參與了口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程。早期檢測miRNA-222有助于口腔鱗狀細(xì)胞癌的輔助診斷及病情評估。

[1] Ahn H, Yang JM, Kim H, et al. Clinicopathologic implications of the miR-197/PD-L1 axis in oral squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2017,8(39):66178-66194.

[2] 王遠(yuǎn)財,程國瓊.miRNA-149在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床有意義[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2014,30(5):458-460,464.

[3] 劉艷華.口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞角蛋白19、乙酰肝素酶的表達(dá)及檢測意義[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2016,23(3):291-293.

[4] Yu X, Zheng H, Chan MT, et al. MicroRNAs: new players in cataract[J]. Am J Transl Res, 2017,9(9):3896-3903.

[5] 張竹青,盧書明,王花麗,等.microRNA-222在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(8):1502-1505.

[6] Fu Z, Qian F, Yang X, et al. Circulating miR-222 in plasma and its potential diagnostic and prognostic value in gastric cancer[J]. Med Oncol, 2014,31(9):164.

[7] Liu S, Sun X, Wang M, et al. A microRNA-221 and 222 mediated feedback loop maintains constitutive activation of NF-κB and STAT3 in colorectal cancer cells[J]. Gastroenterology, 2014,147(4):847-859.

[8] Pathiyil V, D′Cruz AM. Salivary lactate dehydrogenase as a prognostic marker in oral squamous cell carcinoma patients following surgical therapy[J]. J Exp Ther Oncol, 2017,11(2):133-137.

[9] Hema KN, Smitha T, Sheethal HS, et al. Epigenetics in oral squamous cell carcinoma[J]. J Oral Maxillofac Pathol, 2017,21(2):252-259.

[10] Han C, Seebacher NA, Hornicek FJ, et al. Regulation of microRNAs function by circular RNAs in human cancer[J]. Oncotarget, 2017,8(38):64622-64637.

[11] Chatterjee N, Rana S, Espinosa-Diez C, et al. MicroRNAs in cancer: challenges and opportunities in early detection, disease monitoring, and therapeutic agents[J]. Curr Pathobiol Rep, 2017,5(1):35-42.

[12] 韓福新,張蕊,馬善波,等.miRNA-21、miR-221、miRNA-222與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2017,12(2):175-177.

[13] 姜訓(xùn)圳,趙科,何向輝.miR-21、miRNA-135b、miRNA-141在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其意義[J].中國普通外科雜志,2014,23(10):1367-1372.

[14] Li JS, Huang HZ, Sun LJ, et al. MiR-21 indicates poor prognosis in tongue squamous cell carcinomas as an apoptosis inhibitor[J]. Clin Cancer Res, 2009,15(12):3998-4008.

[15] Motawi TM, Sadik NA, Shaker OG, et al. Elevated serum microRNA-122/222 levels are potential diagnostic biomarkers in Egyptian patients with chronic hepatitis C but not hepatic cancer[J]. Tumour Biol, 2016,37(7):9865-9874.

[16] Cao Y, Yu SL, Wang Y, et al. MicroRNA-dependent regulation of PTEN after arsenic trioxide treatment in bladder cancer cell line T24[J]. Tumour Biol, 2011,32(1):179-188.

江西省衛(wèi)計委科技計劃項(xiàng)目(20167037)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.030

R739.8

B

1002-266X(2017)48-0087-03

2017-09-22)