劉克洪 李景琦 高 堅(jiān) (武警浙江省總隊(duì)杭州醫(yī)院康復(fù)中心，浙江 杭州 310051)

普拉格雷干預(yù)對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機(jī)制

劉克洪 李景琦 高 堅(jiān) (武警浙江省總隊(duì)杭州醫(yī)院康復(fù)中心，浙江 杭州 310051)

目的考察普拉格雷對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機(jī)制。方法雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和普拉格雷組3組，每組40只。假手術(shù)組與模型組灌胃給予生理鹽水，普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥14 d。記錄或檢測各組行為障礙、組織病理學(xué)改變、腦內(nèi)半胱天冬酶(Caspase)-3及程序化死亡基因(PDCD)-5表達(dá)情況，外周血超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與假手術(shù)組比，模型組及普拉格雷組神經(jīng)功能評分升高顯著(P<0.05)；與模型組比較，普拉格雷組神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組細(xì)胞排列紊亂，水腫嚴(yán)重，血管充血；與模型組比較，普拉格雷組腦組織結(jié)構(gòu)較完整，且壞死及水腫程度降低。與假手術(shù)組比，模型組可見大量Caspase-3和PDCD-5細(xì)胞(P<0.05)，SOD明顯降低(P<0.05)，MDA、NSE和S-100β明顯增高(P<0.05)；與模型組比，普拉格雷組Caspase-3和PDCD-5細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，SOD明顯增高(P<0.05)，MDA、NSE和S-100β明顯降低(P<0.05)。結(jié)論普拉格雷可以通過抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子，調(diào)控SOD、MDA、NSE及S-100β表達(dá)從而改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙。

普拉格雷；腦梗死；半胱天冬酶-3；程序化死亡基因；超氧化物歧化酶；丙二醛；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；S-100β

腦梗死后神經(jīng)功能的改善成為近年來研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，針對腦梗死動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，抑制凋亡及保護(hù)神經(jīng)成為治療的重點(diǎn)〔1〕。普拉格雷作為第三代血小板抑制劑，可與P2Y12受體相結(jié)合，從而發(fā)揮更強(qiáng)更迅速的抗血小板聚集作用，是一種已處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)的藥物〔2〕，然而有關(guān)普拉格雷可否改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能的研究至今缺如，其可改善神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制也未知。本文探究普拉格雷對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 雄性Wistar大鼠(北京維通利華公司)120只，8～10周齡，體重180～220 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和普拉格雷組各40只。

1.2腦梗死大鼠的制備 大鼠全麻后置于操作臺(tái)上，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎ECA及CCA近心端。在CCA近分叉處插入備用魚線，將栓線送至大腦中動(dòng)脈分叉處，平均進(jìn)線(18.5±0.5)mm(ECA與ICA分叉處為起點(diǎn))，栓線尾端留于皮膚外，栓塞90 min后抽線實(shí)現(xiàn)再灌注。以大鼠清醒后爬行時(shí)右轉(zhuǎn)圈，提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲為納入標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組操作同上，僅暴露各組血管，而不進(jìn)行線栓插入〔3〕。

1.3給藥 假手術(shù)組和模型組均灌胃給予生理鹽水，劑量10 ml·kg-1·d-1，普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥14 d。

1.4神經(jīng)功能評分〔3〕記錄所有大鼠治療后的神經(jīng)功能評分。0分：活動(dòng)自如，未有障礙；1分：存在活動(dòng)障礙，左側(cè)前爪無力；2分：存在活動(dòng)障礙，推手術(shù)側(cè)肩部，發(fā)現(xiàn)對側(cè)的移動(dòng)阻力降低；3分：存在活動(dòng)障礙，大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)圈；4分：活動(dòng)障礙明顯，無肢體活動(dòng)。分值越高提示行為障礙越明顯。

1.5腦組織病理 治療后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠處死，取腦組織，參照固定-脫水-包埋-切片-染色等步驟，光鏡觀察病理形態(tài)。

1.6Caspase-3及程序化死亡基因(PDCD)-5在腦組織的表達(dá) 選擇1.5的切片，按照脫蠟-透明-脫水-抗原修復(fù)-抗體孵育-染色等步驟，光鏡觀察Caspase-3及PDCD-5表達(dá)情況。按染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)比例確定陽性情況，無著色0分，<1%為1分、1%～10%為2分，11%～33%為3分，34%～66%為4分，67%～100%為5分，染色強(qiáng)度按無、弱、中和強(qiáng)分別為0、1、2和3分，陽性細(xì)胞百分率評分+細(xì)胞染色強(qiáng)度評分≥3為陽性，否則為陰性。

1.7外周血超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)表達(dá) 治療前后，自大鼠眼球取血，靜置2 h，離心取血清，按照說明書操作步驟〔3〕，并應(yīng)用儀器檢測吸光度并計(jì)算SOD和MDA的相對含量。SOD和MDA試劑購于美國CST公司。

1.8外周血神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達(dá) 治療前后，自大鼠眼球取血，高速離心取上清，以酶標(biāo)儀采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定NSE及S-100β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，NSE及S-100β試劑盒均購于R&D公司。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組治療前后的神經(jīng)功能評分 治療前，與假手術(shù)組比較，模型組及普拉格雷組神經(jīng)功能評分較治療前顯著升高(P<0.05)，治療后，普拉格雷組神經(jīng)功能評分較治療前顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，普拉格雷組神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織病理學(xué)比較 假手術(shù)組腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組細(xì)胞排列紊亂，水腫嚴(yán)重，血管充血；與模型組比較，普拉格雷組腦組織結(jié)構(gòu)較完整，且壞死及水腫程度降低，見圖1。

表1 各組治療前后的神經(jīng)功能評分分)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組腦Caspase-3及PDCD-5表達(dá) 假手術(shù)組未見Caspase-3 和PDCD-5陽性細(xì)胞，模型組見大量Caspase-3〔32例(80.00%)〕和PDCD-5陽性細(xì)胞〔35例(87.50%)〕(χ2=53.333，62.222，均P=0.000)；與模型組比較，普拉格雷組Caspase-3 和PDCD-5陽性率〔17例(42.50%)、15例(37.50%)〕明顯降低(χ2=8.717,P=0.003 0;χ2=21.333,P=0.000 0)，見圖2。

2.4各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較 治療前，與假手術(shù)組比較，模型組及普拉格雷組SOD顯著降低(P<0.05)，MDA顯著升高(P<0.05)；治療后，較治療前普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05)，MDA顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05)，MDA顯著降低(P<0.05)，見表2。

圖1 各組腦組織的HE染色(×400)

圖2 各組腦組織Caspase-3及PDCD-5表達(dá)(×400)

2.5各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較 治療前，與假手術(shù)組比較，模型組及普拉格雷組NSE及S-100β顯著增高(P<0.05)；治療后，普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05)，見表3。

表2 各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較分)

表3 各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較分)

3 討 論

腦梗死發(fā)生機(jī)制不明，但腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡及氧自由基增高，促使多種腦組織損傷特異性蛋白，如NSE及S-100β分泌增多，誘導(dǎo)腦組織神經(jīng)功能的損傷。NSE多由神經(jīng)元細(xì)胞分泌，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)特異性蛋白，生理狀態(tài)下的血清水平較低，難以被檢測到，但當(dāng)顱內(nèi)缺血缺氧時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)的NSE即進(jìn)入血液循環(huán)，外周血增高的NSE可作為顱內(nèi)損傷的標(biāo)志物〔4～7〕；S-100β可在多種腦內(nèi)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但表達(dá)受限，參與腦細(xì)胞的多種代謝過程，被認(rèn)為是腦損傷的特異性標(biāo)記蛋白〔8～10〕。

腦梗死發(fā)病的重要因素之一是細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑和死亡受體通路均可干預(yù)凋亡，這三種通路均需要激活下游Caspase-3和PDCD-5等凋亡蛋白才能發(fā)揮誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡的作用。Caspase-3為通路中的關(guān)鍵因子，是啟動(dòng)凋亡的重要分子〔11〕。PDCD-5具有早期及始動(dòng)性的功能，參與線粒體凋亡通路〔12〕。本文結(jié)果提示腦梗死大鼠腦部存在明顯的細(xì)胞凋亡。

生理?xiàng)l件下，機(jī)體具有清除體內(nèi)多余自由基的功能，然而在缺血缺氧的情況下，氧自由基聚集，損傷腦組織。SOD作為最主要的抗氧化酶，可有效清除體內(nèi)氧自由基；而MDA與線粒體膜的穩(wěn)定性相關(guān)，兩者的含量可反映機(jī)體氧自由基情況〔13,14〕。本文結(jié)果提示腦梗死大鼠的氧自由基代謝紊亂。

普拉格雷作為一種新型的抗血小板藥物，是一種前體藥物，可在體內(nèi)活化為活性物質(zhì)，與血小板受體結(jié)合從而發(fā)揮更有效的抗血小板聚集的效果。研究多認(rèn)為普拉格雷具有較好的預(yù)防和改善心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的功能〔15,16〕。

本文說明普拉格雷可以明顯降低腦梗死大鼠顱內(nèi)凋亡程度。普拉格雷可以顯著減輕腦梗死大鼠氧自由基的分泌。普拉格雷可以降低腦特異性損傷蛋白的分泌，參與腦梗死的修復(fù)。既往研究〔13〕顯示，抗血小板療法可誘發(fā)大腦皮層發(fā)生依賴性神經(jīng)功能重組的變化，使腦梗死恢復(fù)期患者大腦皮層發(fā)生功能重組變化，使患肢運(yùn)動(dòng)功能得到恢復(fù)。普拉格雷療法可以通過減輕顱內(nèi)凋亡程度、氧自由基分泌狀況及腦損傷蛋白的合成改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙，然而有關(guān)其深入機(jī)制的研究仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1李秀芹,高 勇.阿托伐他汀聯(lián)合尤瑞克林對急性腦梗死患者臨床療效及內(nèi)皮素水平的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2016;36(9):2146-8.

2吳禹蒙,程荔春,梁 晶,等.替格瑞洛對比普拉格雷對血小板反應(yīng)性影響的Meta分析〔J〕.中國藥房,2016;27(15):2083-6.

3張貫石,賈芙蓉,王 輝,等.臍血單個(gè)核細(xì)胞治療大腦中動(dòng)脈閉塞性腦梗塞大鼠后行為學(xué)及膽堿能變化〔J〕.中國免疫學(xué)雜志,2014;30(9):1186-8，1194.

4于玉娟,高成杰,王曉鵬,等.帕瑞昔布鈉對腦腫瘤切除術(shù)患者炎癥反應(yīng)的影響及腦保護(hù)作用〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016;54(6):65-8,86.

5陳曉梅,陳廣福.右美托咪定對顱內(nèi)腫瘤手術(shù)患者血流動(dòng)力學(xué)的影響及腦保護(hù)作用〔J〕.臨床麻醉學(xué)雜志,2015;31(1):15-7.

6程奎山,戴益斌,謝軍朋,等.腦梗塞再灌注患者血清NSE及S-100β蛋白變化及丁苯酞的干預(yù)作用〔J〕.海南醫(yī)學(xué),2016;27(19):3102-4.

7鄒 斌,張兆輝.尤瑞克林聯(lián)合曲克盧丁對急性腦梗塞患者凝血功能及神經(jīng)功能的影響〔J〕.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015;21(6):841-3,846.

8謝小娟,李前輝,宋紹團(tuán),等.右美托咪定復(fù)合芬太尼及七氟烷對幕上腦腫瘤患者血清NSE、S-100β、SOD和MDA含量及腦氧供需平衡的影響〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017;46(1):76-9,93.

9尚 云,馬慧敏,郭喜霞,等.促紅細(xì)胞生成素對宮內(nèi)感染致腦損傷早產(chǎn)新生大鼠神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和S-100β表達(dá)的影響〔J〕.中國兒童保健雜志,2014;22(10):1047-50.

10童世君,金利明,李 祥.外源性硫化氫對大鼠心肺復(fù)蘇后大腦中動(dòng)脈血流、血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶及S-100β蛋白的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2017;37(8):1843-5.

11郭映輝,馮志山,邵智利,等.新生兒缺氧缺血性腦病血清IL-18和Caspase-3及S-100B蛋白水平檢測及臨床意義〔J〕.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014;37(4):276-80.

12曲貝貝,左金華,朱玉紅,等.Survivin和 PDCD5在黏液表皮樣癌組織中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2016;32(2):225-9.

13Choudhary R,Bodakhe SH.Magnesium taurate prevents cataractogenesis via restoration of lenticular oxidative damage and ATPase function in cadmium chloride-induced hypertensive experimental animals〔J〕.Biomed Pharmacother,2016;8(84):836-44.

14Hedayati Kashka R,Zavareh S,Lashkarbolouki T.Augmenting effect of vitrification on lipid peroxidation in mouse preantral follicle during cultivation:modulation by coenzyme Q10〔J〕.Syst Biol Reprod Med,2016;62(6):1-11.

15樹 源,黃家卓.普拉格雷在行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的急性冠脈綜合征患者中的應(yīng)用效果〔J〕.實(shí)用心腦肺血管病雜志,2016;24(5):109-12.

16洪 峰,馬青青.普拉格雷治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的療效觀察〔J〕.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2016;28(6):781-2.

R743.3

A

1005-9202(2017)24-6038-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.015

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.LY12H09006)

李景琦(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腦損傷意識(shí)障礙康復(fù)研究。

劉克洪(1983-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)損傷康復(fù)研究。

〔2016-11-29修回〕

(編輯 苑云杰)