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心脈隆注射液對阿霉素所致心肌細胞損傷的保護機制研究

袁李禮1，蔣宇2

目的探討心脈隆注射液對阿霉素所致心肌細胞損傷的保護作用和機制。方法建立阿霉素所致的H9C2心肌細胞損傷模型，并采用心脈隆注射液干預。采用CCK8法測定心肌細胞活性，檢測細胞超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，檢測Caspase-3活性，WesternBlot分析Caspase-3表達，免疫熒光分析細胞自噬相關蛋白LC3B。結果與對照組比較，阿霉素組細胞活性明顯降低(P<0.05)；SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；心脈隆注射液干預后細胞活性較阿霉素組高(P<0.05)，SOD含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性；與對照組比較，阿霉素組Caspase-3活性和表達明顯升高(P<0.05)，LC3B綠色熒光聚積，心脈隆注射液干預后較阿霉素組Caspase-3活性和表達均降低(P<0.05)，LC3綠色熒光聚積減少。結論心脈隆注射液能減輕阿霉素所致心肌細胞損傷和氧化應激，可能與其調節(jié)自噬和凋亡有關。

心肌細胞損傷；心脈隆注射液；阿霉素；自噬；超氧化物歧化酶；丙二醛

阿霉素作為一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥，臨床上常用于白血病、淋巴瘤、乳腺癌等疾病治療[1]，取得顯著效果，但其引起的心臟毒性效應使其臨床應用受到限制[2]，如何防治阿霉素心臟毒性是臨床和基礎關注的重要問題和研究熱點。心脈隆注射液是美洲大蠊中分離出的一種新型藥物，有研究表明其具有抗氧化和心臟保護作用[3-4]，但對阿霉素所致心臟損傷的作用機制尚不完全明確。本研究觀察心脈隆注射液對阿霉素所致心肌細胞損傷的影響，并進一步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠心肌細胞系H9C2細胞(中科院上海細胞庫)，心脈隆注射液(云南騰藥)、阿霉素(上海阿拉丁)，DMEM低糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素鏈霉素(Gibco)，CCK8試劑(日本同仁)，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒(江蘇碧云天)，BCA蛋白定量試劑盒(WellBiology)，兔抗LC3B單克隆抗體(Sigma)，鼠抗Caspase-3單克隆抗體(Proteintech)，熒光二抗(Invitrogen)，β-actin抗體(博士德)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組H9C2細胞接種于DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃、待細胞生長至融合度80%～90%，以1∶3比例傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細胞分為對照組、阿霉素組、阿霉素+心脈隆組；對照組采用常規(guī)培養(yǎng)，阿霉素組采用5μg/mL阿霉素處理，阿霉素+心脈隆注射液組采用5μg/mL阿霉素處理同時給予不同濃度心脈隆注射液。

1.2.2CCK8法分析心肌細胞活性 以5×103個細胞/孔接種于96孔板，分組處理，對照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+不同濃度心脈隆注射液組(5μg/mL阿霉素+0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL心脈隆注射液)，每組設6個復孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLCCK8試劑，孵育2h后，使用酶標儀450nm處測定吸光度。

1.2.3SOD和MDA試劑盒分析心肌細胞氧化應激 以5×103個細胞/孔接種于96孔板，分組處理，對照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+不同濃度心脈隆注射液組(5μg/mL阿霉素+0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL心脈隆注射液)，每組設6個復孔，培養(yǎng)48h后，收集細胞，分別采用試劑盒檢測心肌細胞SOD和MDA，具體操作依照試劑盒說明書進行。

1.2.4Caspase-3活性檢測和WesternBlot分析心肌細胞凋亡 以105個細胞/孔接種于24孔板，分組處理，對照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+心脈隆注射液組(5μg/mL阿霉素+0.75mg/mL心脈隆注射液)，每組設6個復孔，培養(yǎng)48h后，收集細胞，使用于Caspase-3活性檢測和WesternBlot分析。Caspase-3活性檢測具體操作依照試劑盒說明書進行；Westernblot檢測：按照RIPA裂解法提取H9C2細胞總蛋白，BCA試劑盒定量，取20μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別以Caspase-3抗體或β-actin抗體孵育過夜后，二抗孵育1h，ECL化學發(fā)光顯影。

1.2.5 免疫熒光分析心肌細胞自噬 將細胞爬片置于24孔板內，以105個細胞/孔接種于24孔板，分組處理，對照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+心脈隆組(5μg/mL阿霉素+0.75mg/mL心脈隆注射液)，每組設4個復孔，培養(yǎng)48h后，多聚甲醛固定，透膜封閉，LC3B一抗孵育過夜后，熒光二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 心脈隆注射液對阿霉素所致H9C2心肌細胞活性的影響 與對照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細胞48h后平均吸光度值明顯降低，細胞活性明顯抑制(P<0.05)；心脈隆注射液處理后平均吸光度值升高，細胞活性較阿霉素處理恢復(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。詳見表1。

表1 心脈隆注射液對阿霉素所致H9C2心肌細胞活性的影響(±s)

2.2 心脈隆注射液對阿霉素所致H9C2心肌細胞氧化應激的影響 與對照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細胞48h后SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)，細胞氧化應激水平升高；與阿霉素組比較，心脈隆注射液處理后SOD含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，緩解其細胞氧化應激狀態(tài)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。詳見表2。

表2 心脈隆注射液對阿霉素所致H9C2心肌細胞氧化應激的影響(±s)

2.3 心脈隆注射液對阿霉素所致H9C2心肌細胞凋亡的影響 與對照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細胞48h后Caspase-3活性升高(P<0.05)；與阿霉素組比較，心脈隆注射液處理后Caspase-3活性降低(P<0.05)，降低其細胞凋亡程度。Westernblot結果顯示：阿霉素阿霉素處理H9C2心肌細胞48h后Caspase-3表達升高，而心脈隆注射液干預后Caspase-3表達降低。詳見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05；與阿霉素組比較，#P<0.05。A為Caspase-3活性檢測；B為Western blot檢測。

2.4 心脈隆注射液對阿霉素所致H9C2心肌細胞自噬的影響 與對照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細胞48h后自噬相關蛋白LC3B綠色熒光聚集；與阿霉素組比較，心脈隆注射液處理后LC3B綠色熒光聚集減少。詳見圖2。

圖2 心脈隆注射液對阿霉素所致H9C2心肌細胞自噬的影響

3 討 論

阿霉素是臨床廣泛應用的廣譜抗腫瘤藥物，其嵌入DNA堿基對之間，阻止DNA依賴性RNA聚合酶的作用，干擾轉錄過程，抑制RNA的生成，阻止DNA的復制，屬于細胞周期非特異性藥物[5]。阿霉素抗腫瘤的臨床效果顯著，但由于其所導致心臟毒性效應而應用受限，目前臨床上用于緩解阿霉素心臟毒性的藥物僅有右丙亞胺[6]，尋找合適的心臟保護藥物是防治阿霉素心臟毒性的有效方法，更有利于阿霉素的臨床應用和療效。

阿霉素所致的心臟毒性機制尚不完全明確，氧自由基學說是較公認的致病機制之一[7]。細胞凋亡認為發(fā)揮重要作用，氧化應激或各種細胞內的改變均可能引起細胞凋亡，加重心肌細胞毒性。近年來，凋亡在阿霉素心臟毒性中的作用日益關注，拮抗心肌細胞凋亡認為是防治阿霉素所致心臟毒性的重要方法之一[8]。心脈隆注射液作為美洲大蠊中提取出的一種新型藥物，其有效成分為復合核苷堿基及結合氨基酸等，臨床上常用于心力衰竭的輔助治療。近期研究表明心脈隆注射液可抑制缺氧導致新生大鼠心肌細胞凋亡[9]，但對阿霉素導致心肌細胞凋亡的影響和作用機制尚未闡明。

本研究觀察H9C2心肌細胞活性和氧化應激水平的改變，明確心脈隆注射液對阿霉素所致心肌細胞損傷的影響，結果顯示阿霉素處理后心肌細胞活性明顯抑制，心脈隆注射液能部分恢復阿霉素所引起的心肌細胞活性抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴性。在氧化應激方面，阿霉素處理后心肌細胞SOD含量降低，MDA含量升高，心脈隆注射液干預能使細胞SOD含量升高，MDA含量降低，部分減輕阿霉素所致的心肌細胞氧自由基清除能力受損和脂質過氧化。證實心脈隆注射液能在一定程度上改善阿霉素所致的心肌細胞活性及氧化應激損傷[10]。

凋亡和自噬間存在復雜的交互調控，二者被多種應激刺激共同激活、互相協(xié)調和轉化[11]。本研究表明阿霉素可導致H9C2心肌細胞凋亡相關分子Caspase-3的活性和表達增加，心脈隆注射液干預減少細胞凋亡程度；同時免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)阿霉素導致H9C2心肌細胞自噬相關蛋白LC3B綠色熒光聚集，心脈隆注射液干預能減少阿霉素處理所引起的LC3綠色熒光的聚集。有研究報道，阿霉素所致的心肌毒性時自噬途徑激活，但自噬清除途徑出現(xiàn)障礙，細胞內有害物質聚積，導致心肌細胞凋亡和心功能的損傷[12]。提示心脈隆注射液可能通過促進自噬清除途徑，減少細胞內有害物質聚積，減輕心肌細胞凋亡和細胞損傷。

綜上所述，心脈隆注射液可減輕阿霉素所致心肌細胞損傷和氧化應激，發(fā)揮對阿霉素化療后心臟毒性的防護作用。從機制上進一步考慮，心脈隆注射液通過促進自噬清除途徑，減輕細胞內有害物質聚積導致心肌細胞凋亡和損傷，發(fā)揮對阿霉素心臟毒性的防護，為心脈隆注射液用于阿霉素心臟毒性的防治提供新思路和實驗依據(jù)。

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R392 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.23.010

1672-1349(2017)23-2977-04

1.湖南省第二人民醫(yī)院(長沙 410007)；2. 湖南省人民醫(yī)院/湖南省急救醫(yī)學研究所

蔣宇，E-mailjiangyu146@hotmail.com

信息：袁李禮，蔣宇.心脈隆注射液對阿霉素所致心肌細胞損傷的保護機制研究J.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(23)：2977-2980.

2017-09-15)

(本文編輯 薛妮)