·臨床研究·

免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD3d、CD4、LCK、IL-7R在淚腺良性淋巴上皮病變組織的表達(dá)及臨床意義

劉驍王蕾馬建民葛心李靜王霄娜

目的檢測(cè)LGBLEL患者病變淚腺標(biāo)本組織中CD3d、CD4、LCK、IL-7R的表達(dá)情況，探討病變組織中CD3d、CD4、LCK、IL-7R的表達(dá)與LGBLEL發(fā)病之間的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LGBLEL患者病變淚腺組織中CD3d、CD4、LCK、IL-7R等蛋白的表達(dá)情況，并以單純眼眶海綿狀血管瘤患者瘤體組織標(biāo)本做對(duì)照。采用半定量積分法(semi-quantitative immunoreactivity scores，IRS)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組標(biāo)本組織中的陽(yáng)性表達(dá)積分值。結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示LGBLEL組CD3d、CD4、LCK、IL-7R蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性；CD3d在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高達(dá)85.5%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)51.8%，總體積分值為強(qiáng)陽(yáng)性(++++)；CD4在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高平均約54.6%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)22.5%，總體積分值為陽(yáng)性(+++)；LCK在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高平均約28.9%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)9.8%，總體積分值為陽(yáng)性(++)；IL-7R在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高平均約9.7%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率平均約4.6%，總體積分值為陽(yáng)性(+)；CD3d、CD4、LCK、IL-7R在腺上皮腺泡的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異，其中CD3d陽(yáng)性表達(dá)率最高，表達(dá)約13.5%，并可見(jiàn)CD3d陽(yáng)性細(xì)胞侵入腺泡現(xiàn)象，CD4陽(yáng)性表達(dá)率次之，表達(dá)約4.5%，偶見(jiàn)侵入腺泡現(xiàn)象。LCK、IL-7R在腺泡的表達(dá)均呈陰性，未見(jiàn)侵入腺泡現(xiàn)象。眼眶海綿狀血管瘤組CD3d、CD4、LCK、IL-7R表達(dá)均呈陰性。結(jié)論CD3d、CD4、LCK、IL-7R因子在LGBLEL病變組織中的表達(dá)異常，CD3d、CD4、LCK、IL-7R因子參與了LGBLEL的發(fā)病過(guò)程。

良性淋巴上皮病變；淚腺；發(fā)病機(jī)制

淚腺良性淋巴上皮病變(lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion, LGBLEL)是一種以淚腺腫大和眼瞼腫脹為主要臨床表現(xiàn)的較為常見(jiàn)的眼眶疾病[1，2]。該病可以發(fā)生于任何年齡、種族、性別的人群，以中年女性多見(jiàn)[3]。該病可以反復(fù)發(fā)作、經(jīng)久不愈[4]，并有惡變的可能[5，6], 是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的眼眶疾病。目前，有關(guān)LGBLEL的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要的假說(shuō)包括上皮-肌上皮島假說(shuō)、病毒誘導(dǎo)假說(shuō)、自身免疫假說(shuō)、激素紊亂假說(shuō)、蛋白紊亂假說(shuō)、IgG4浸潤(rùn)假說(shuō)等[7]。這些假說(shuō)雖然可以從不同側(cè)面對(duì)該病發(fā)病進(jìn)行解釋?zhuān)几鞔鏍?zhēng)議，有待更深入的研究。近年來(lái)，隨著組織胚胎學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)了多種淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物，這些標(biāo)志物為觀測(cè)淋巴管生成開(kāi)辟了新的途徑。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)CD3d、CD4、LCK、IL-7R分子在病變組織中的表達(dá)情況，以探討淋巴組織增生及淋巴管生成的發(fā)病機(jī)理。

資料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

選取2010年8月至2016年10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院眼腫瘤專(zhuān)科進(jìn)行手術(shù)切除淚腺組織并經(jīng)病理組織學(xué)確診的20例LGBLEL患者病變淚腺標(biāo)本組織和10例單純眼眶海綿狀血管瘤患者瘤體組織。本實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，并與患者簽署知情同意書(shū)。

二、取材

將手術(shù)切除的LGBLEL患者病變淚腺標(biāo)本組織和眼眶海綿狀血管瘤患者瘤體組織先用PBS緩沖液沖洗干凈，去除血污，將標(biāo)本分為兩部分，其中一部分放入凍存管中，置于-80 ℃冰箱低溫保存；另一部分用10%福爾馬林固定，并交由上海生工生物工程有限公司對(duì)標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋后切片，制作成石蠟切片。

三、主要耗材與試劑

兔抗人CD3d抗體和兔抗人CD4抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人LCK抗體和鼠抗人IL-7R抗體(美國(guó) Abcam公司)，通用二步法試劑盒和DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司) 山羊血清(美國(guó)Gibco公司)等。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.將石蠟切片烤片后經(jīng)脫蠟、水化；抗原修復(fù)；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；封閉；加一抗；加二抗；加DAB液、復(fù)染，脫水，封片等步驟行免疫組化染色后放倒置相差顯微鏡觀察切片的染色結(jié)果并照相。

2.免疫組化結(jié)果判讀：以CD3d、CD4、IL-7R細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，LCK細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。分別計(jì)數(shù)整體病變淚腺組織、增生淋巴濾泡、淋巴濾泡間區(qū)、腺泡4個(gè)部位的陽(yáng)性表達(dá)率，在腺泡的表達(dá)只要一圈腺上皮中出現(xiàn)1個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞即算為陽(yáng)性。采用半定量積分法(semi-quantitative immunoreactivity scores，IRS)計(jì)算整體病變淚腺組織陽(yáng)性表達(dá)積分值。顯微鏡下低倍鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)染色視野，轉(zhuǎn)換高倍鏡，對(duì)每個(gè)視野的陽(yáng)性率(視野內(nèi)陽(yáng)性所占面積的百分比)及視野內(nèi)染色程度分別進(jìn)行分級(jí)計(jì)分，取3個(gè)視野的平均值。陽(yáng)性細(xì)胞面積≤5%：0分、5%～25%：1分、25%～50%：2分、50%～75%：3分、≥75%：4分。著色強(qiáng)度依據(jù)深淺記分，無(wú)著色：0分、淺著色：1分、深著色：2分。根據(jù)兩項(xiàng)相乘的分?jǐn)?shù)為最后的積分值：≤1.0為陰性(-)，1.1～2.0為弱陽(yáng)性(+)，2.1～3.0為陽(yáng)性(++)，3.1～4.0為陽(yáng)性(+++)，≥4.0為強(qiáng)陽(yáng)性(++++)。

結(jié) 果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：對(duì)照組單純眼眶海綿狀血管瘤CD3d、CD4、LCK、IL-7R均為陰性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組病變淚腺組織CD3d、CD4、LCK、IL-7R表達(dá)結(jié)果(見(jiàn)圖1～4)。實(shí)驗(yàn)組腺泡CD3d、CD4、LCK、IL-7R表達(dá)結(jié)果(見(jiàn)圖5～8)。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:CD3d在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高達(dá)85.5%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)51.8%，均呈深著色，總體最后的積分值，≥4.0為強(qiáng)陽(yáng)性(++++)；CD4在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高平均約54.6%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)22.5%，均呈深著色，總體最后的積分值，3.1～4.0為陽(yáng)性(+++)；LCK在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高平均約28.9%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)9.8%，均呈深著色，總體最后的積分值，2.1～3.0為陽(yáng)性(++)；IL-7R在淋巴濾泡周?chē)?yáng)性表達(dá)率高平均約9.7%，在淋巴濾泡間區(qū)陽(yáng)性表達(dá)率平均約4.6%，均呈深著色，總體最后的積分值，1.1～2.0為陽(yáng)性(+)；CD3d、CD4、LCK、IL-7R在腺上皮腺泡的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異，其中CD3d陽(yáng)性表達(dá)率最高，表達(dá)約13.5%，并可見(jiàn)CD3d陽(yáng)性細(xì)胞侵入腺泡現(xiàn)象，CD4陽(yáng)性表達(dá)率次之，表達(dá)約4.5%，偶見(jiàn)侵入腺泡現(xiàn)象。LCK、IL-7R在腺泡的表達(dá)均呈陰性，未見(jiàn)侵入腺泡現(xiàn)象。對(duì)照組單純眼眶海綿狀血管瘤患者病變淚腺組織CD3d、CD4、LCK、IL-7R均表達(dá)陰性。見(jiàn)表1～2。

圖1 LGBLEL組織CD3d+10×10倍圖2 LGBLEL組織CD4+10×10倍圖3 LGBLEL組織LCK+10×10倍圖4 LGBLEL組織IL-7R+10×10倍圖5 LGBLEL腺泡CD3d+10×20倍圖6 LGBLEL腺泡CD4+10×20倍圖7 LGBLEL腺泡LCK-10×20倍圖8 LGBLEL腺泡IL-7R-10×20倍

表1 GBLEL患者整體病變淚腺組織、增生淋巴濾泡、淋巴濾泡間區(qū)、腺泡CD3d、CD4、LCK、IL-7R陽(yáng)性表達(dá)率情況比較(%)

組別CD3dCD4LCKIL-7R整體病變淚腺組織68.738.619.47.2DW增生淋巴濾泡85.554.628.99.7增生淋巴濾泡間區(qū)51.822.59.84.6腺泡13.54.500

表2 GBLEL患者與單純眼眶海綿狀血管瘤患者病變淚腺組織CD3d、CD4、LCK、IL-7R整體表達(dá)情況比較

組別例數(shù)CD3dCD4LCKIL-7RGBLEL組20++++++++++單純眼眶海綿狀血管瘤組10----

討 論

LGBLEL是一種危害人類(lèi)健康的眼科疾病，患者以中老年女性雙眼發(fā)病較為多見(jiàn)，臨床表現(xiàn)主要為雙眼或單眼無(wú)痛性眼瞼腫脹，眼眶MRI掃描顯示雙側(cè)或單側(cè)眼瞼腫脹伴淚腺?gòu)浡阅[大、脫垂，病情遷延反復(fù)，存在一定的惡變傾向。病理改變表現(xiàn)為腺小葉結(jié)構(gòu)仍存在，小葉內(nèi)腺泡間有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，繼而腺泡破壞消失，為密集的淋巴細(xì)胞和組織細(xì)胞所代替，小葉內(nèi)導(dǎo)管增生擴(kuò)張，患者因?qū)Ч苌掀ぴ錾纬蓪?shí)性上皮團(tuán)塊，表現(xiàn)為良性淋巴組織病變。

淋巴結(jié)為人體重要的免疫器官和防御屏障，廣泛分布于人體的皮膚、黏膜及血管周?chē)?，常受到各種因子的刺激，如各類(lèi)病原微生物感染、化學(xué)藥物、外來(lái)的毒物、異物、機(jī)體自身的代謝產(chǎn)物、變性壞死的組織成分等多種因素的都可作為抗原或致敏原刺激淋巴結(jié)內(nèi)細(xì)胞成分，主要是淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的增生，導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大。近來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在炎性病變條件下，淋巴管生成顯著增強(qiáng)。組織及血管間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，他們能分泌多種促炎性細(xì)胞因子，參與了淋巴管的生成過(guò)程。這些促炎性細(xì)胞因子主要包括白細(xì)胞介素1α，IL-1β，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-4、IL-7、IL-8等[8]。 因此，在成人某些病理情況下，激活一套特殊的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)轉(zhuǎn)變從毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表型所需要的分子程序，來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分化[9]。

本實(shí)驗(yàn)選用單純眼眶海綿狀血管瘤患者術(shù)后標(biāo)本作為對(duì)照組，原因主要有以下3個(gè)[10]：(1)單純眼眶海綿狀血管瘤是一種已經(jīng)被證明的先天性血管發(fā)育畸形，與炎癥反應(yīng)和免疫作用無(wú)明顯相關(guān)，而LGBLEL目前認(rèn)為是一種與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病。選用單純眼眶海綿狀血管瘤作為對(duì)照組不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)組的研究目的有所干擾。(2)單純眼眶海綿狀血管瘤發(fā)病率較高，標(biāo)本易收集。北京同仁醫(yī)院眼腫瘤科每年收治的單純眼眶海綿狀血管瘤手術(shù)標(biāo)本近80例，故有較多的標(biāo)本量供采用。(3)正常的淚腺組織難以獲取。

CD3分子主要存在于T細(xì)胞表面，由6條肽鏈組成，與T細(xì)胞受體結(jié)合參與TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其主要功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞受體識(shí)別抗原所產(chǎn)生的活化信號(hào)。CD3分子處于外周血中并是其中成熟的T 淋巴細(xì)胞中最好標(biāo)志物(marker) 之一，測(cè)定CD3+T淋巴細(xì)胞對(duì)評(píng)價(jià)免疫缺陷癥、白血病、淋巴瘤的分型診斷具有重要意義。CD4分子是人類(lèi)免疫系統(tǒng)中一類(lèi)重要的免疫分子，主要表達(dá)在Th細(xì)胞，是Th細(xì)胞識(shí)別抗原的受體，參與Th細(xì)胞識(shí)別抗原的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD4分子是T淋巴細(xì)胞的重要標(biāo)志物，可檢測(cè)機(jī)體免疫功能、對(duì)白血病和淋巴瘤的免疫分型診斷及免疫抑制療法的評(píng)價(jià)具有重要意義。LCK又稱T淋巴細(xì)胞酪氨酸激酶，是效應(yīng)T細(xì)胞形成的必要因子，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中具有重要作用，對(duì)LCK中的編碼基因在細(xì)菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式進(jìn)行研究，可有助于揭示抗菌免疫的分子機(jī)制。白介素7受體(interleukin-7 receptor,IL-7R)是T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所必需的細(xì)胞因子，它可激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞 以及樹(shù)突狀細(xì)胞。IL-7R與自身免疫密切相關(guān)。起重癥聯(lián)合免疫缺陷病是由IL-7R在細(xì)胞表面的缺失所導(dǎo)致的。

本研究檢測(cè)了LGBLEL病變組織的CD3 d、CD4、LCK、IL-7R分子表達(dá)水平，免疫組化定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD3d在LGBLEL病變淚腺組織高表達(dá)，在增生淋巴濾泡的周邊部位表達(dá)明顯增高，在濾泡間區(qū)也表達(dá)增高，腺泡也可見(jiàn)浸潤(rùn)性表達(dá)，說(shuō)明CD3d陽(yáng)性細(xì)胞即T淋巴細(xì)胞在LGBLEL病變淚腺組織發(fā)病中起主要作用；CD4陽(yáng)性細(xì)胞偶見(jiàn)侵入腺泡現(xiàn)象。LCK、IL-7R在腺泡的表達(dá)均呈陰性，未見(jiàn)侵入腺泡現(xiàn)象。CD3d、CD4、LCK、IL-7R屬于原發(fā)免疫缺陷(primary immunodeficiency)通路的主要作用因子[11]，原發(fā)免疫缺陷通路是免疫反應(yīng)中的較為少見(jiàn)的一條信號(hào)通路，它的功能及機(jī)制研究尚不明確，有研究顯示原發(fā)免疫缺陷通路在原發(fā)性免疫缺陷病和艾滋病等疾病的發(fā)病過(guò)程中起到重要作用，所以就體液免疫、細(xì)胞免疫、自身免疫及原發(fā)免疫缺陷等多種免疫通路選取恰當(dāng)細(xì)胞因子對(duì)LGBLEL病變組織的間質(zhì)、腺泡及所形成的淋巴濾泡進(jìn)行定位標(biāo)記，對(duì)揭示LGBLEL的病因及發(fā)病機(jī)制會(huì)有重要意義。

總而言之，本研究結(jié)果表明淚腺良性淋巴上皮病變組織標(biāo)本中CD3d、CD4、LCK、IL-7R異常表達(dá)參與了LGBLEL的發(fā)病過(guò)程，但其詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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UsingtheimmunohistochemicalexamtoanalysetheexpressionandclinicalsignificanceofCD3d,CD4,LCKandIL-7Rinlacrimalbenignlymphoepitheliallesion

LiuXiao，WangLei，MaJianmin，GeXin，LiJing，WangXiaona.

BeijingTongrenEyeCenter，BeijingKeyLaboratoryofOphthalmologyandVisualScience，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijng100730，China

ObjectiveDetecting the expression of CD3d,CD4,LCK,IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion and discussing whether it is related to the pathogenesis of lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion.MethodsUsing the immunohistochemical exam to detect the expression of CD3d,CD4,LCK,IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion and orbital cavernous hemangioma was considered as control group. The integral value of positive expression in the experimental group and the control group was calculated by semi quantitative immunoreactivity scores.ResultsThe expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R were elevated in LGBLEL. The positive rate of CD3d expression in the lymphoid follicle is as high as 85.5%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 51.8%, the overall score is strongly positive (+ + + +).The positive rate of CD4 expression in the lymphoid follicle is about 54.6%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 22.5%, the overall score is positive (+ + +). The positive rate of LCK expression in the lymphoid follicle is about 28.9%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 9.8%, the overall score is positive (++).The positive rate of IL-7R expression in the lymphoid follicle is about 9.7%, in the interfollicular zones the positive expression rate is 4.6%, the overall score is positive (+).The expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R have showed the significant differences in the expression of glandular epithelial acinus, the positive expression of CD3 d is the highest, the expression rate is about 13.5%, and you can see the CD3d positive cells invade the acinar. The positive expression of CD4 is about 4.5%, and you can see the CD4 positive cells occasionally invaded acini. The expressions of LCK and IL-7R are negative in acini, there is no invasion of acini.The expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R were normal in orbital cavernous hemangioma.ConclusionThe increased expression of CD3d, CD4, LCK, IL-7R in lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion may participate in the pathogenesis of lacrimal gland benign lymphoepithelial lesion.

Benign lymphoepithelial lesion;Lacrimal gland;Pathogenesis

[JClinOphthalmol,2017,25:385]

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.05.001

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81371052)

100730 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院

馬建民(Email:jmma@sina.com)

[臨床眼科雜志，2017，25：385]

(收稿：2017-05-22)