胡文良，鄭艷秋，孫學威

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，內蒙古 呼和浩特 010050)

·論 著·

頭頸部鱗癌的基因模塊化分析及潛在抗癌藥物篩選

胡文良，鄭艷秋，孫學威

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，內蒙古 呼和浩特 010050)

目的利用生物信息學模塊化分析方法，篩選頭頸部鱗癌中的功能性基因模塊，為頭頸部鱗癌的研究和治療提供新的靶點。方法獲取GEO數(shù)據庫中頭頸部鱗癌的全基因組數(shù)據(GSE6631)后，利用R語言limma包篩選頭頸部鱗癌中差異表達基因。通過STRING數(shù)據庫，建立頭頸部鱗癌中差異表達基因的蛋白-蛋白互作網絡。然后，利用Cytoscape軟件的MCODE插件篩選頭頸部鱗癌中的基因模塊。利用DAVID數(shù)據庫，獲得模塊功能。最后，挖掘模塊基因中的蛋白激酶基因并利用Selleckchem數(shù)據庫篩選其激酶抑制劑。結果共篩選出頭頸部鱗癌中的差異表達基因929個(P＜0.05且|Fold Change|≥2)。根據String數(shù)據庫，發(fā)現(xiàn)這些差異基因中共有5 588個蛋白質互作對，并據此建立鼻咽癌中的蛋白質互作網絡。利用MCODE方法在蛋白質互作網絡中共篩選出3個基因模塊。GO分析顯示這些模塊與頭頸部鱗癌的關系十分密切，主要包括參與細胞周期、細胞增殖、細胞黏附、細胞凋亡等重要腫瘤細胞活動。3個模塊包含3個蛋白激酶基因，即CDK1、CDK4和CDK5，共篩選出調控它們的39個激酶抑制劑，其中20個對頭頸部鱗癌的作用還不清楚，具有成為抗癌新藥的潛力。結論頭頸部鱗癌中的3個功能性基因模塊可能在頭頸部鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，20個激酶抑制劑可能通過調控CDK家族基因來調控頭頸部鱗癌的發(fā)生發(fā)展，這些功能性模塊的挖掘和激酶抑制劑的篩選可能為頭頸部鱗癌的研究和治療提供新的靶點。

頭頸部鱗癌；基因模塊化分析；生物信息；激酶抑制劑

頭頸部鱗癌是一類影響鼻腔、口腔和咽喉部的惡性腫瘤。該疾病不僅本身能夠危及人類生命而且接受相關治療的頭頸部鱗癌患者還必須承受一些嚴重的并發(fā)癥，包括進食、吞咽、呼吸困難和喪失語言能力等[1-2]。每年約有65萬人被診斷為頭頸部鱗癌，這使其成為世界第6大常見癌癥，5年生存率約為60%[1]。研究清楚發(fā)病機制是改善頭頸部鱗癌診斷和治療的關鍵?；蚰K化分析作為一種重要的生物信息學方法，能夠幫助筆者在包含海量致病基因的網絡中挖掘出具有重要致病功能的基因團，即基因模塊[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)激酶抑制劑在癌癥的治療上取得了顯著成效，部分激酶抑制劑被應用于臨床[4]。本研究中，筆者利用生物信息學方法篩選GEO數(shù)據庫中頭頸部鱗癌樣本中的差異表達基因并建立蛋白互作網絡，在網絡中篩選具有重要作用的基因模塊，并利用相關數(shù)據庫篩選出能夠靶向調控基因模塊中激酶基因的激酶抑制劑，以期為頭頸部鱗癌的發(fā)病機制研究和治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 頭頸部鱗癌樣本中差異表達基因的篩選GEO數(shù)據庫中的GSE6631數(shù)據集包含22例頭頸部鱗癌樣本和22例癌旁對照樣本的全基因組數(shù)據。筆者利用R語言的limma包檢測頭頸部鱗癌中的差異表達基因[5]。表達倍數(shù)(Fold Change)≥2.0且矯正P值＜0.05的基因被認為有差異表達。

1.2 頭頸部鱗癌中蛋白互作網絡的建立 String數(shù)據庫(http://string-db.org/)是一個收錄了大量已知蛋白質之間和預測蛋白質之間互作關系的知名系統(tǒng)。根據String數(shù)據庫的蛋白質互作關系和頭頸部鱗癌中的差異表達基因，筆者建立了頭頸部鱗癌中的蛋白質-蛋白質互作(protein-protein interaction，PPI)網絡。

1.3 基因模塊的篩選 基于上一步建立的頭頸部鱗癌PPI網絡，筆者利用Cytoscape 3.4(http://www.cytoscape.org/)軟件中的MCODE插件挖掘頭頸部鱗癌PPI網絡中的基因模塊，并利用Cytoscape 3.4軟件生成基因模塊圖[6]。

1.4 基因模塊的功能分析 為了確定已篩選的模塊功能，筆者利用DAVID數(shù)據庫(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，http://david.ncifcrf.gov/)對這些基因模塊分別進行功能Gene Ontology(GO)分析。

1.5 潛在抗癌藥物的篩選 首先，在利用上述方法獲得頭頸部鱗癌的基因模塊后，篩選出這些模塊中的蛋白激酶基因。然后，利用Selleckchem網站(http：//www.selleckchem.com/)篩選出目的激酶的抑制劑。再利用文獻挖掘技術(Thomson Data Analyzer軟件，http：//thomsonreuters.com/thomson-data-analyzer/)，在Pubmed數(shù)據庫中以“激酶抑制劑”和“頭頸部鱗癌”為關鍵詞，篩選出目的激酶抑制劑在癌癥研究方面的文獻數(shù)量，以預測潛在的頭頸部鱗癌治療新藥物。

1.6 統(tǒng)計學方法 本次實驗利用R語言limma軟件對GSE6631數(shù)據集中頭頸部鱗癌組織和癌旁組織中基因的表達量進行t檢驗[5]，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05且差異表達倍數(shù)≥2.0的基因為差異表達基因。利用DAVID數(shù)據庫對GO功能分析的結果進行Fisher精確檢驗[3]，P＜0.05的GO功能具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 差異表達基因 利用R語言limma包檢測44例頭頸部鱗癌樣本中的差異表達基因，結果顯示共有929個基因發(fā)生差異表達(矯正P值＜0.05且|Fold Change|≥2)。

2.2 蛋白互作網絡和基因模塊 根據STRING數(shù)據庫和上述篩選出差異表達基因，發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗癌的929個基因共包含5 588個蛋白質互作關系對。然后，利用Cytoscape軟件建立了頭頸部鱗癌中的PPI網絡，如圖1。模塊化分析的結果顯示頭頸部鱗癌的PPI網絡中包含3個基因模塊，分別命名為模塊1～3，如表 1和圖 2所示。模塊 1由 CDK1、CDC6、CDK14等41個基因構成；模塊2包括FN1、CD44、PLK4等45個基因；模塊3包含CAD、TAF4、HSPA5等31個基因。

圖1 頭頸部鱗癌中的PPI網絡

表1 模塊信息

圖2 頭頸部鱗癌PPI網絡中的基因模塊

2.3 基因模塊功能 GO分析的結果顯示，模塊1～3的功能均與頭頸部鱗癌的關系十分密切。模塊1的功能包括細胞周期(cell cycle)、細胞分裂(cell division)、細胞增殖(cell proliferation)等；模塊2的功能包括細胞周期(cell cycle)、細胞黏附(cell adhesion)、血管生成(blood vessel development)、細胞增殖(cell proliferation)等；模塊3的功能包括能量代謝過程(GTP biosynthetic process)、基因表達(gene expression)、凋亡調控(negative regulation of apoptotic process)等(P＜0.05)，見表2。

表2 基因模塊功能

2.4 潛在抗癌藥物篩選 研究表明，激酶抑制劑具有顯著的抗腫瘤作用，已在臨床抗腫瘤治療中取得良好效果。本次實驗篩選上述模塊中的蛋白激酶及其抑制劑，以期為頭頸部鱗癌的分子靶向治療提供新的切入點。在模塊1、2和3中共發(fā)現(xiàn)4個蛋白激酶，它們均為周期蛋白依賴性激酶(CDK)家族成員，分別為CDK1、CDK4、CDK5和CDK14。利用Selleckchem數(shù)據庫篩選出CDK1的激酶抑制劑21個、CDK4的激酶抑制劑10個和CDK5的激酶抑制劑3個，如表3所示。目前，數(shù)據庫還沒有收錄CDK14相關的激酶抑制劑。文獻挖掘的結果顯示，在CDK1、CDK4和CDK5的激酶抑制劑中分別有6個、7個和1個已被發(fā)現(xiàn)與頭頸部鱗癌關系密切。其他20個激酶抑制劑在頭頸部鱗癌中的作用還不清楚。

表3 調控頭頸部鱗癌的激酶抑制劑篩選

3 討 論

近年來，隨著海量實驗數(shù)據的產生，生物信息學作為常用的大數(shù)據分析手段，能夠快速且有效的識別出數(shù)據網絡中更有價值的信息，例如，基因模塊化分析技術能夠為筆者呈現(xiàn)在基因網絡中可視化和模塊化的核心信息。本實驗中篩選出在頭頸部鱗癌中差異表達的基因并構建其PPI網絡，利用MCODE軟件識別網絡中的基因模塊，進而挖掘在頭頸部鱗癌中發(fā)揮重要調控作用的基因靶點。

筆者在頭頸部鱗癌的PPI網絡中挖掘出3個重要的基因模塊。模塊1和模塊2的功能均包含對細胞周期和細胞增殖的調控。研究表明，細胞周期紊亂導致細胞發(fā)生失控性生長是腫瘤的本質[7]。因此，找出對頭頸部鱗癌細胞周期有調控作用的基因靶點對于抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要。筆者發(fā)現(xiàn)模塊1中包含若干周期蛋白依賴性激酶(CDK)家族成員基因，例如：CDK1、CDK4、CDK5等。研究表明，CDK家族對于調節(jié)腫瘤細胞周期具有重要作用。Bednarek等[8]發(fā)現(xiàn)CDK1在喉癌中高表達且參與早期腫瘤形成；Benerjee等[9]發(fā)現(xiàn)CDK4與頭頸部癌癥患者的生存率呈顯著負相關；Sun等[10]發(fā)現(xiàn)CDK5能夠調節(jié)頭頸部鱗癌的上皮間質化轉變。這些結果說明這些CDK家族基因對頭頸部鱗癌具有重要的調控作用。然而，它們之間的互相作用是否在頭頸部鱗癌中也發(fā)揮作用還不清楚。本次實驗結果提示CDK1、CDK4和CDK5等細胞周期調控基因可能在模塊1中發(fā)揮密切的互相作用并發(fā)揮調控細胞周期的作用，同時干預這些CDK靶點可能比調控單一靶點更有意義。此外，模塊1和膜塊2還對細胞增殖能力具有重要的調控作用，例如模塊1中的MCM7和BUB1基因和模塊2中的CDC27和BUB1B。Pickhard等[11]發(fā)現(xiàn)BUB1可以作為預測頭頸部鱗癌預后的潛在靶點；Wang等[12]發(fā)現(xiàn)MCM7在頭頸部鱗癌中高表達，但它們在頭頸部鱗癌中的調控機制還不清楚。本次研究結果提示這些基因發(fā)揮作用可能是通過模塊1和模塊2的基因互作來實現(xiàn)的。功能分析的結果顯示模塊2參與細胞黏附和血管生成等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的細胞活動。Baschnagel等[13]發(fā)現(xiàn)CD44與頭頸部鱗癌的預后密切相關；Jerhammar等[14]發(fā)現(xiàn)FN1是頭頸部鱗癌預后的重要指標。CD44和FN1均為模塊2中的重要基因，它們可能與頭頸部鱗癌的關系十分密切，但其作用機制還不清楚。本實驗的結果提示它們可能通過與模塊2的基因發(fā)生互作來調節(jié)腫瘤細胞的黏附能力和血管生成能力，從而調節(jié)其轉移能力，最終影響患者生存率。除模塊1和2外，模塊3也能夠參與重要的腫瘤活動，例如調節(jié)腫瘤細胞凋亡。模塊3中BARD1被證實在乳腺癌中發(fā)生基因突變并且調節(jié)腫瘤細胞凋亡[15]，但其在頭頸部鱗癌中作用尚不清楚。本次實驗結果提示模塊3中的BARD1可能參與了頭頸部鱗癌的凋亡調控過程。綜上，模塊1～3參與了頭頸部鱗癌的多種細胞活動，部分模塊基因在頭頸部鱗癌中的作用已被證實，但是還有很多基因與頭頸部鱗癌的作用還尚不清楚，這些基因可能通過與其他模塊基因發(fā)生互相作用，從而調節(jié)頭頸部鱗癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，模塊1～3中的基因有潛力成為頭頸部鱗癌研究和治療的新靶點。

近年來，轉化醫(yī)學思想逐漸興起，實驗室成果如何向臨床應用轉化成為熱點問題，激酶抑制劑因其顯著的抗腫瘤作用，得到了廣泛研究，其在臨床中的應用也取得了迅猛發(fā)展。本次實驗中，筆者篩選出可能通過調控CDK激酶來調控頭頸部鱗癌發(fā)生發(fā)展的激酶抑制劑39個。其中，19個已被發(fā)現(xiàn)與頭頸部鱗癌關系密切，例如，Mishra等[16]發(fā)現(xiàn)CDK4激酶抑制劑P276-00能夠通過上調P53和抑制CDK4來抑制頭頸部鱗癌的發(fā)展。這些結果證明筆者篩選結果的準確性。值得注意的是，其他20個激酶抑制劑在頭頸部鱗癌中的作用還不清楚，但是它們可能通過調節(jié)CDK激酶來調節(jié)頭頸部鱗癌的發(fā)生發(fā)展，具有成為頭頸部鱗癌靶向治療藥物的潛力。

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Functional gene module analysis and screening of potential anticancer drugs for head and neck squamous cell carcinoma.

HU Wen-liang,ZHENG Yan-qiu,SUN Xue-wei.Department of Otolaryngology,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,Inner Mongolia,CHINA

ObjectiveTo screen the functional gene modules of head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC)with protein-protein interaction(PPI)network,and to provide new cut points for research and therapy of HNSCC.MethodsGEO dataset(GSE6631)and R language limma package were employed to screen the differentially expressed genes in HNSCC.PPI network was established by using String database.Based on the network,the gene modules were identified by using bioinformatics gene module analysis method of MCODE plug in of Cytoscape software.Go analysis(DAVID database)was used to analyze the function of gene modules.After screening the kinase genes in the modules,Selleckchem database was used to identify their kinase inhibitors.ResultsIn this study,929 differentially expressed genes were identified in HNSCC(P＜0.05 and|Fold Change|≥2).There were 5 588 PPI pairs among the differentially expressed genes based on String database.The PPI network was established based on these pairs.Three gene modules were identified by using bioinformatics methods(MCODE).GO analysis results showed that the function of the gene modules includes regulation of cell cycle,cell adhesion,cell proliferation,cell apoptosis.There were three kinase genes in the 3 gene modules(CDK1,CDK4 and CDK5).A total of 39 kinase inhibitors that inhibit three kinase genes were screened out.Among them,the effect of the 20 inhibitors in the development of HNSCC is still not clear,which have the potential to be the new anti-cancer drugs.ConclusionThere are three gene modules playing the important roles in the progression and development of HNSCC.Moreover,20 kinase inhibitors may regulate HNSCC through regulating CDKs.Our finding can provide the target for the research and therapy of HNSCC.

Head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC);Gene module analysis;Bioinformatics;Kinase inhibitor

R739.91

A

1003—6350（2017）22—3613—05

內蒙古醫(yī)科大學科技百萬工程項目（編號：KJbw2013014）

孫學威。E-mail：immu_sunxuewei@163.com

2017-06-12)