王 莎 吳白雪 劉超陽 秦光成 周冀英 陳力學(xué)△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，重慶400016；2 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016 )

?論 著?

ASIC3在慢性偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)脊束尾核的表達(dá)*

王 莎1吳白雪1劉超陽1秦光成1周冀英2陳力學(xué)1△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，重慶400016；2重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016 )

目的：本文通過檢測酸敏感離子通道3 (acid sensing ion channel 3, ASIC3)在慢性偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)脊束尾核(trigeminal nucleus caudalis, TNC)的表達(dá)變化，探討其在慢性偏頭痛發(fā)病中的作用及可能機(jī)制。方法：將SD 雄性大鼠隨機(jī)分為7組，假手術(shù)組 (n= 18)，模型組 (n= 18)，模型+溶劑組 (n= 5)，模型+ ASIC3抑制劑5 μM組 (n= 5)，模型+ ASIC3抑制劑10 μM組 (n= 5)，模型+ASIC3激動(dòng)劑100 μM組 (n= 5)，模型+ASIC3激動(dòng)劑200 μM組 (n= 5)。使用Von Frey纖維絲測定大鼠眶周及足底的機(jī)械痛閾值，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) (qRT-PCR) 檢測ASIC3 mRNA，蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 檢測ASIC3、CGRP蛋白表達(dá)，免疫熒光技術(shù)檢測ASIC3和CGRP在TNC部位的表達(dá)和定位情況。結(jié)果：(1) 硬腦膜反復(fù)給予“炎性湯”后，大鼠眶周及足底的機(jī)械痛閾值顯著降低 (P＜ 0.01)；(2) 與Sham組相比，CM組大鼠ASIC3在TNC的表達(dá)明顯升高 (P＜ 0.05)；(3) 給予ASIC3抑制劑后，大鼠眶周及足底機(jī)械痛閾值均顯著增加 (P＜ 0.05)，CGRP蛋白的表達(dá)也明顯降低 (P＜ 0.05)，而給予ASIC3激動(dòng)劑后，大鼠眶周及足底機(jī)械痛閾值均顯著降低 (P＜ 0.05)，CGRP蛋白的表達(dá)明顯增加 (P＜ 0.05)；(4) 免疫熒光檢測顯示在TNC部位，ASIC3主要表達(dá)于神經(jīng)元，且與CGRP有少量共表達(dá)。結(jié)論：ASIC3在慢性偏頭痛大鼠TNC部位表達(dá)上調(diào)，且通過調(diào)節(jié)機(jī)械痛閾值的變化及CGRP的表達(dá)參與了慢性偏頭痛的發(fā)生發(fā)展過程。

慢性偏頭痛；ASIC3；三叉神經(jīng)脊束尾核

偏頭痛是一種臨床上常見的神經(jīng)功能障礙性疾病，以反復(fù)發(fā)作為特征，慢性偏頭痛是其嚴(yán)重類型，發(fā)作時(shí)多表現(xiàn)為單側(cè)的搏動(dòng)樣疼痛，可伴有畏光、畏聲、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重影響病人的日常生活和工作。調(diào)查表明，慢性偏頭痛在普通人群中患病率為1%～3%[1]，偏頭痛病人中，每年約有2.5%～3.0%由發(fā)作性偏頭痛 (episodic migraine,EM) 發(fā)展為慢性偏頭痛 (chronic migraine, CM)[2]，然而目前尚無治療慢性偏頭痛的有效方法，因此探索慢性偏頭痛的發(fā)生機(jī)制及其治療手段尤其重要。

慢性偏頭痛的病生理機(jī)制尚不清楚，目前多認(rèn)為可能與疼痛通路調(diào)控異常、中樞敏化、皮質(zhì)興奮性增高及神經(jīng)源性炎癥有關(guān)，其中神經(jīng)肽類物質(zhì)如降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)和神經(jīng)激肽A等的釋放以及所導(dǎo)致的神經(jīng)源性炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致偏頭痛慢性化的關(guān)鍵機(jī)制之一[3～5]。酸敏感離子通道3(Acidsensing ion channel 3)是一種與痛覺及傷害性感受密切相關(guān)的陽離子通道[6,7]，對酸性環(huán)境極敏感，ASIC3主要表達(dá)于外周神經(jīng)傳入纖維。在偏頭痛研究中，已證實(shí)ASIC3在外周三叉神經(jīng)感受中的重要作用，ASIC3的活化不僅可激活硬腦膜傳入纖維還可促進(jìn)CGRP的釋放，引起神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)生[8,9]。然而關(guān)于ASIC3是否在偏頭痛的慢性化病理機(jī)制發(fā)揮作用研究甚少，本研究通過建立慢性偏頭痛大鼠模型，首次觀察到ASIC3不僅在中樞二級神經(jīng)元TNC部位表達(dá)明顯增加，并且可調(diào)節(jié)大鼠機(jī)械痛閾的變化以及CGRP的釋放，這為探索慢性偏頭痛的機(jī)制及治療方法提供了新的方向。

方 法

1.材料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠61只，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（渝）2012-0001，體重250～300 g，隨機(jī)分成7組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均放置于溫度為22 ± 2℃、濕度為50 ± 5%的環(huán)境中，保證正常晝夜規(guī)律，自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行試驗(yàn)，為避免手術(shù)過程引起的腸麻痹，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食禁水12 h。

（2）主要試劑

“炎性湯”，包括組胺(1 mmol/L)、5-羥色胺(1 mmol/L)、緩激肽 (1 mmol/L) 和前列腺素E2(0.1 mmol/L)，均購自Sigma–Aldrich，用PBS稀釋；兔抗大鼠ASIC3抗體、APETx2、GMQ (Alomone Labs)；兔抗大鼠CGRP抗體 (Abcam)、小鼠抗大鼠CGRP抗體 (Santa Cruz)、小鼠抗大鼠NeuN (Millipore)、Cy3標(biāo)記的山羊抗兔 (Proteintech)、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠(Proteintech)、DAPI (Beyotime)、兔抗大鼠β-actin抗體(Proteintech)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒( Beyotime )，TRIzol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，ECL化學(xué)發(fā)光顯影液(Beyotime)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）大鼠慢性偏頭痛模型的建立

參照 Melo-Carrillo[10]等人的實(shí)驗(yàn)方法：采用硬腦膜反復(fù)給予“炎性湯”(in fl ammatory soup, IS)刺激的方法建立大鼠慢性偏頭痛模型。大鼠稱重，10%水合氯醛腹腔麻醉(4 ml/kg)，將大鼠固定于立體定位儀上。頭部正中去毛、消毒，沿頭部正中剪開長約1 cm的切口，逐層分離皮下組織直至顱骨表面暴露清晰。用顱骨鉆鉆取直徑約1 mm的骨窗，避免損傷硬腦膜，在骨窗安裝微量軟管，周圍用牙托粉和牙托水固定，逐層縫合，涂抹新霉素預(yù)防感染。術(shù)后將大鼠置于37℃恒溫板上，待蘇醒后放回籠中單獨(dú)喂養(yǎng)。術(shù)后恢復(fù)一周，選擇傷口恢復(fù)良好的大鼠進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。CM組大鼠硬腦膜滴注IS 2 μl，使用微螺旋定量推進(jìn)裝置勻速緩慢泵入，Sham組給予同樣體積的PBS (0.01 M)，重復(fù)7天。

（2）側(cè)腦室注射

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)側(cè)腦室給予ASIC3的特異性抑制劑 APETx2，分為低濃度組（5 μM, 每只 5 μl）、高濃度組（10 μM, 每只5 μl），ASIC3的激動(dòng)劑GMQ，即低濃度組（100 μM, 每只 5 μl）、高濃度組（200 μM, 每只5 μl）。滴注7天“炎性湯”后，將大鼠麻醉、固定在立體定位儀上，常規(guī)消毒，用止血鉗取出安置的微量套管，清理、分離周圍組織，使顱骨暴露清晰，在前囟向左1.5 mm，向后1 mm處，用顱骨鉆鉆取直徑約1 mm骨窗。將微量注射器用立體定位儀固定，從顱骨窗平面向下進(jìn)入約4 mm到達(dá)側(cè)腦室，勻速緩慢地泵入干預(yù)試劑，約10 min。試劑注射完成后留針5 min再拔出，骨窗用骨蠟封閉，逐層縫合皮膚，將大鼠放置于37℃恒溫板上，待蘇醒后放回籠中。

（3）大鼠機(jī)械痛閾值的檢測

參照 Oshinsky[10]的實(shí)驗(yàn)方法，檢測每次給藥前的基礎(chǔ)機(jī)械痛閾值的變化。將大鼠分別放入透明籠子中適應(yīng)30 min，使用電子Von Frey纖維絲測痛儀(WoodLand Hills, CA, USA) 測定大鼠面部及后爪足底的機(jī)械痛閾值。用痛閾儀纖維絲的頭端輕觸大鼠眶周或后爪足底的皮膚，當(dāng)大鼠出現(xiàn)頭部快速撤回、發(fā)聲、用爪搔抓面部或剝開纖維絲、抬足、甩足時(shí)為陽性反應(yīng)，記錄痛閾值，重復(fù)測量3次，間隔時(shí)間為10 min，取其平均值作為該部位的機(jī)械痛閾值。

（4）實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，分離TNC部位凍存于液氮中。按照Takara的TRIzol試劑盒說明書提取TNC的總RNA，用分光光度法測定其濃度，然后以此為模板逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系 20 μl反應(yīng)如下：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 min，所得cDNA保存于-20℃待用。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， ASIC3上游引物5’-TAAGACCACCCTGGATGAGC-3’， 下 游 引物 5’-TCCAGATGGGCAGATACTCC- 3’。 內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-ATG ACT CTA CCC ACG GCA AG- 3’，下游引物：5’-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT- 3’。取適量體積逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，在CFX-96熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，條件如下：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，65℃ 5 s，循環(huán)50 次，通過軟件得到各組相應(yīng)的Cq值，用2-ΔΔCT值表示其基因的相對表達(dá)量。

（5）蛋白質(zhì)印跡法

大鼠麻醉后斷頭取腦，迅速分離TNC部位，保存于-80℃待用。取適量組織，加入相應(yīng)體積含有 PMSF (Beyotime, China)的RIPA組織裂解液(Beyotime, China)，用超聲勻漿器充分勻漿后置

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。于4℃冰箱裂解90 min。然后低溫離心15 min，12 000 rpm，取其上清液用BCA法測定蛋白濃度。向蛋白樣品中加入5xSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(Beyotime, China)，100℃水浴變性5 min。取適量體積蛋白樣品上樣，配制10%的SDS-PAGE凝膠電泳2 h，恒流電轉(zhuǎn)(250 mA, 1.5 h)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2～3 h，孵育一抗：兔抗大鼠ASIC3 (1:400)，兔抗大鼠CGRP(1:2 000)，兔抗大鼠 β-actin (1:2 000)，4℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，然后滴加二抗由HRP標(biāo)記的山羊抗兔(1:8 000)，37℃孵育1.5 h，TBST漂洗3次，每次10 min。采用ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光顯影，灰度值使用Fusion軟件進(jìn)行分析，以 β-actin 作為參照，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

（6）免疫熒光染色

大鼠麻醉后用生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心灌注，分離腦組織，放于4%多聚甲醛中后固定24 h，然后用20%的蔗糖溶液脫水24 h，換為30%的蔗糖溶液繼續(xù)脫水72 h。將處理好的腦組織放于冰凍切片機(jī)中，切取10 μm厚的腦片，放于-80℃保存?zhèn)溆谩BS洗片后滴加0.3% Triton穿破細(xì)胞膜，37℃孵育10 min，用PBS充分洗片后加山羊血清進(jìn)行封閉，于37℃孵育30 min，隨后擦掉血清滴加一抗混液，包括兔抗大鼠ASIC3 (1:100)、小鼠抗大鼠CGRP (1:100)、小鼠抗大鼠NeuN (1:100)，4℃孵育過夜。次日用PBS沖洗后滴加二抗，包括Cy3標(biāo)記的山羊抗兔 (1:60)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠 (1:60)，于37℃孵育1.5 h，隨后用PBS洗片，滴加DAPI，37℃孵育5 min，最后用PBS洗片并用50%甘油封片，保存于4℃冰箱備用。

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.機(jī)械痛閾值檢測

用von Frey纖維絲檢測大鼠硬腦膜滴注前的基礎(chǔ)機(jī)械痛閾。當(dāng)給予PBS后大鼠出現(xiàn)縮頭行為學(xué)表現(xiàn)，而給予IS后，大鼠出現(xiàn)發(fā)聲、縮頭、用后爪搔抓面部、爬籠等行為學(xué)表現(xiàn)，表明建模成功。IS組大鼠眶周和足底的痛閾值依次下降，自第3次滴注前的痛閾值顯著下降(5.64 ± 0.60 g; 11.57 ±1.58 g)，與首次之間(8.11 ± 0.80 g; 17.46 ± 0.70 g)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜ 0.05, 見圖1)；而PBS組7次滴注前痛閾值變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2. ASIC3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量的檢測

通過qRT-PCR反應(yīng)檢測在兩組大鼠TNC部位ASIC3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，在CM組大鼠TNC部位ASIC3 mRNA的表達(dá)量明顯高于Sham組 (P＜ 0.05, 見圖 2B)。Western bloting 結(jié)果同樣表明CM組的ASIC3蛋白表達(dá)顯著高于Sham組 (P＜0.05, 見圖 2A)。

3.給予干預(yù)試劑后機(jī)械痛閾值和CGRP蛋白表達(dá)的檢測

圖1 PBS (Sham組) /IS (CM組) 7次滴注前眶周(A)和后足(B)的機(jī)械痛閾值(n = 10,±SD)**P ＜ 0.01，與首次痛閾值相比Fig.1 Periorbital and hindpaw mechanical pain threshold in PBS (Sham) group and IS (CM) group before 7 times infusions(n = 10,±SD)

圖2 CM組大鼠TNC部位ASIC3 mRNA (B)和蛋白(A)的表達(dá)明顯增加(±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與 Sham 組相比Fig.2 The mRNA and protein expressions of ASIC3 in TNC in two groups of rats, which were increased signi fi cantly in CM group compared with the Sham group (±SD)

在給予7次IS滴注后，經(jīng)側(cè)腦室給予ASIC3的抑制劑APETx2和激動(dòng)劑GMQ。CM組(3.57 ± 0.45 g; 6.98 ± 0.38 g)和 CM+DMSO 組(3.80 ± 0.66 g; 7.20 ± 1.41 g) 眶周與足底的痛閾值與Sham組 (7.76 ± 0.78 g; 17.57 ± 0.99 g) 比較明顯降低 (P＜ 0.05, 見圖3)，而CM組和CM+DMSO組之間痛閾值無顯著差異，表明溶劑對痛閾值無明顯影響。給予ASIC3抑制劑后，與CM+DMSO組相比，大鼠眶周 (6.38 ± 0.69 g, 5.53 ± 0.40 g)及后足 (11.17 ± 0.73 g, 11.46 ± 0.91 g) 的痛閾值顯著增高 (P＜ 0.05)，但兩種濃度的抑制劑對痛閾值的影響無明顯差異。給予ASIC3激動(dòng)劑后發(fā)現(xiàn)，與CM + DMSO組相比，大鼠眶周 (2.39 ± 0.55 g,2.01 ± 0.33 g) 及足底 (4.27 ± 0.64 g, 4.78 ± 0.83 g)的痛閾值顯著降低 (P＜ 0.05)，且與使用的兩種不同的濃度無明顯關(guān)系，表明痛閾值與干預(yù)試劑的濃度無依賴性。CGRP蛋白表達(dá)在 CM 組大鼠中顯著增高 (P＜ 0.05, 見圖4)，而給予ASIC3抑制劑可顯著降低CGRP的表達(dá) (P＜ 0.05)，給予ASIC3激動(dòng)劑后CGRP的表達(dá)顯著增高 (P＜ 0.05)。

4.免疫熒光檢測結(jié)果

采用免疫熒光技術(shù)檢測ASIC3、CGRP在TNC部位的表達(dá)及定位情況，結(jié)果顯示，ASIC3表達(dá)于神經(jīng)元，且在神經(jīng)元的胞膜和胞質(zhì)均有表達(dá)。CGRP主要表達(dá)于TNC的Ⅰ-Ⅱ?qū)?，呈顆粒狀，并且ASIC3與CGRP有少量共表達(dá)（見圖5）。

圖3 給予ASIC3抑制劑和激動(dòng)劑后眶周(A)和后足(B)痛閾值的變化 (±SD)*P ＜ 0.05，與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05，與 CM+DMSO組相比Fig.3 The changes of thresholds in periorbital and hindpaw after administration of ASIC3 inhibitor and agonist(±SD)*P ＜ 0.05, compared with the Sham group; #P ＜ 0.05,compared with the CM+DMSO group.

討 論

慢性偏頭痛的病理生理機(jī)制尚未闡明，理想的慢性偏頭痛模型應(yīng)可以模擬CM病人頭痛發(fā)作的特征以及由急性演變成慢性痛的過程，但在目前的慢性偏頭痛動(dòng)物模型中，如硬腦膜神經(jīng)炎癥模型、硝酸甘油模型、基因修飾模型[11]等，均不能完全模擬這種過程。本實(shí)驗(yàn)基于三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活是偏頭痛發(fā)病的重要機(jī)制這一假說，參照Melo-Carrillo[10]的實(shí)驗(yàn)方法，給予硬腦膜化學(xué)刺激，建立硬腦膜神經(jīng)源性炎癥模型。即反復(fù)滴注IS，激活硬腦膜周圍傷害感受器，促使三叉神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)肽類物質(zhì)，如降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)，導(dǎo)致血管擴(kuò)張、血漿外滲及肥大細(xì)胞脫顆粒，引起神經(jīng)源性炎癥[3]。本課題組已報(bào)道[12]多次給予IS不僅可誘發(fā)大鼠偏頭痛發(fā)作，并且可促進(jìn)中樞敏化的發(fā)展并引起皮膚的異常性疼痛，即表現(xiàn)為外周的痛覺過敏和痛覺超敏[13]，IS作為一種復(fù)合致炎劑已被廣泛用于CM的模型研究。

圖4 CGRP在各組的表達(dá) (±SD)*P ＜ 0.05，與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05，與 CM +DMSO組相比Fig.4 The expression of CGRP in different groups (±SD)*P ＜ 0.05, compared with the Sham group; #P ＜ 0.05,compared with the CM + DMSO group.

圖5 免疫熒光檢測ASIC3、CGRP在TNC部位的定位：A-E:TNC部位，DAPI（藍(lán)色），NeuN （綠色）與ASIC3（紅色）重合；F-J:TNC部位，DAPI（藍(lán)色），CGRP（綠色）與ASIC3（紅色）部分重合bar：A, F = 500 μm，B, C, D, G, H, I = 75 μm，E, J = 25 μmFig.5 Location of ASIC3 and CGRP in TNC detected by immuno fl uorescence

ASICs屬于上皮鈉離子通道/退化蛋白 (ENaC/DEG) 超家族成員，是一種感受細(xì)胞外酸堿環(huán)境的陽離子通道，可被氫離子激活，主要通透鈉離子和少量的鈣離子[14]。迄今為止，ASICs共發(fā)現(xiàn)4種基因編碼6種酸敏感離子通道亞基蛋白即ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3 和 ASIC4[15]，Krishtal和Pidoplichko[16]于1980年發(fā)現(xiàn)，pH的驟降可引起大鼠三叉神經(jīng)元大量的鈉離子傳導(dǎo)，因此提出酸敏感離子通道的概念和體內(nèi)存在“質(zhì)子受體”的理論[17]，在此基礎(chǔ)上，歷經(jīng)30余年的研究，Yan[9]團(tuán)隊(duì)不僅明確了ASICs在外周傷害感受中的作用，還證實(shí)了在酸性環(huán)境中硬腦膜傳入纖維可被激活并且在炎癥反應(yīng)條件下被敏化。前期研究結(jié)果均顯示ASICs在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且為主要中介物質(zhì)。而在這些亞基中，ASIC3對胞外PH值的降低最為敏感(PH0.5= 6.7)[15]。研究表明，ASIC3主要分布在外周背根神經(jīng)節(jié)，此外，軟骨組織、心臟、胃也有表達(dá)，在傷害性感受和傳遞中起重要作用[18,19]，另有研究顯示，硬腦膜可被酸性細(xì)胞外環(huán)境直接激活且這種作用主要由ASIC3介導(dǎo)，活化的ASIC3可引起鈉離子大量內(nèi)流，產(chǎn)生動(dòng)作電位，激活傷害感受器并促進(jìn)三叉神經(jīng)元中CGRP大量釋放，且這種作用不依賴胞內(nèi)的鈣離子，從而導(dǎo)致頭痛發(fā)作，而預(yù)先給予ASIC3的特異性抑制劑APETx2處理，偏頭痛的行為可被減輕，證實(shí)ASIC3在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中的重要作用[20]。

本實(shí)驗(yàn)通過硬腦膜外置管，在大鼠清醒狀態(tài)下連續(xù)給予7天的IS，引起三叉神經(jīng)傷害感受器的反復(fù)激活，建立慢性偏頭痛大鼠模型，觀察大鼠行為學(xué)及組織學(xué)變化。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著IS滴注次數(shù)的增多，CM組大鼠眶周及后爪的機(jī)械痛閾值明顯降低，腦干TNC部位CGRP表達(dá)顯著增加，同時(shí)ASIC3蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，提示多次滴注IS可促使偏頭痛的慢性化，引起大鼠皮膚的異常性疼痛，這與臨床上慢性偏頭痛病人的表現(xiàn)類似，并且ASIC3在慢性偏頭痛病生理機(jī)制中起著重要作用。

研究表明，在慢性偏頭痛病理機(jī)制中，CGRP在腦干區(qū)作為一種興奮性遞質(zhì)被釋放，繼而誘發(fā)TNC以及下丘腦的中樞敏化[21,22]，并且，在臨床研究中，慢性偏頭痛受試者腦脊液中CGRP的水平較對照組明顯增加[23]，故理論上CGRP可作為慢性偏頭痛的生化指標(biāo)。APETx2是ASIC3的一種選擇性抑制劑，可特異性地阻斷ASIC3，減少傷害性感受的傳遞[24]。本研究顯示，經(jīng)側(cè)腦室給予APETx2后，大鼠眶周及后爪的機(jī)械痛閾顯著增高，并可明顯減少CGRP的表達(dá)，這表明通過阻斷ASIC3可影響慢性偏頭痛的發(fā)展。GMQ為ASIC3非特異性激動(dòng)劑[25]，給予GMQ后可顯著降低大鼠的機(jī)械痛閾值以及增加CGRP的表達(dá)，這與ASIC3可促進(jìn)三叉神經(jīng)元釋放CGRP的結(jié)果相一致。熒光染色顯示ASIC3主要表達(dá)于TNC部位的神經(jīng)元胞膜和胞質(zhì)，并與CGRP有少量的共表達(dá)，表明ASIC3不僅表達(dá)于周圍神經(jīng)系統(tǒng)，參與疼痛的感受和傳遞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有表達(dá)，尤其在腦干TNC部位的表達(dá)顯著增加，并能調(diào)節(jié)神經(jīng)肽CGRP的釋放，這些結(jié)果提示ASIC3可能參與慢性偏頭痛的病生理機(jī)制，但ASIC3究竟是通過哪些中間機(jī)制參與慢性偏頭痛的發(fā)生有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。而本研究局限于單一造模方法及痛閾指標(biāo)的檢測進(jìn)行研究，也需進(jìn)一步完善。

綜上所述，本文證實(shí)了ASIC3在慢性偏頭痛發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，為臨床上慢性偏頭痛的治療提供了新的靶點(diǎn)。

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EXPRESSION OF ASIC3 IN TRIGEMINAL NUCLEUS CAUDALIS IN A RAT MODEL OF CHRONIC MIGRAINE*

WANG Sha1, WU Bai-Xue1, LIU Chao-Yang1, QIN Guang-Cheng1, ZHOU Ji-Ying2, CHEN Li-Xue1Δ
(1Laboratory Research Center, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China2; Chongqing Key Laboratory of Neurology, Chongqing 400016, China)

Objective: The purpose of this study was to detect the expression of acid-sensing ion channel 3(ASIC3) in trigeminal nucleus caudalis (TNC) in a rat model of chronic migraine (CM) and to explore its role in the pathogenesis of chronic migraine. Methods: Sprague-Dawley male rats were randomly divided into 7 groups: They were Sham (n= 18), CM (n= 18), CM+DMSO (n= 5), CM+APETx2 5 μM(n= 5), CM+APETx2 10 μM (n= 5), CM+GMQ 100 μM (n= 5) and CM+GMQ 200 μM (n=5). Then the mechanical pain thresholds of periorbital and hindpaw were measured by Von Frey filaments.Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to examine the expression of ASIC3 mRNA. Expression of ASIC3 and CGRP protein were examined by Western blotting. Localization of ASIC3 and CGRP in TNC were examined by immuno fl uorescence. Results: (1) Mechanical pain thresholds of rats in periorbital and hindpaw were greatly decreased after repeatitive administration of "inflammatory soup"(P＜ 0.01). (2) ASIC3 expression in CM group was signi fi cantly higher than that in sham group (P＜ 0.05).(3) Mechanical pain threshold was significantly enhanced when treated with ASIC3 antagonist APETx2(P＜ 0.05), furthermore, the protein expression of CGRP was significantly reduced (P＜ 0.05). In addition,mechanical pain threshold was sharply decreased after activation of ASIC3 by its agonist GMQ, and the expression of CGRP was increased (P＜ 0.05). (4) Immunofluorescence assay showed that ASIC3 was mainly expressed in TNC neurons and was co-expressed with CGRP. Conclusion: ASIC3 protein levels is up-regulated in the TNC of chronic migraine rats and participates in the development of chronic migraine by regulating the changes of mechanical pain threshold and the expression of CGRP.

Chronic migraine; ASIC3; Trigeminal nucleus caudalis

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.12.004

國家自然科學(xué)基金(No. 81671093, No. 81500957)；重慶市渝中區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(20160107)

△通訊作者 chenlixue@hospital.cqmu.edu.cn