蔣增海，徐耀輝*，鄧同煒，趙攀登

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

豬源沙門菌分離鑒定與耐藥性分析

蔣增海1,2，徐耀輝1,2*，鄧同煒1,2，趙攀登1,2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

2015年9月和2016年10月，河南省兩豬場暴發(fā)保育仔豬的急性死亡，為了弄清原因，采集心血、肺臟和肝臟病料，通過常規(guī)分離、PCR鑒定、生化試驗，分離到2株沙門菌，分別命名為HenanSep1、HenanSq2N。小鼠致病性試驗結(jié)果顯示，每只小鼠接種0.2 mL菌液，其濃度為5×108CFU/mL，均導(dǎo)致小鼠發(fā)病，但是無死亡。選取21種藥物，采用K-B法對2個分離株進行藥物敏感性測定。藥敏試驗結(jié)果表明，2株沙門菌對頭孢噻呋、氨芐西林、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、磺胺異惡唑、氯霉素、恩諾沙星耐藥，對美羅培南、亞胺培南、氨曲南、多黏菌素B、土霉素敏感，對其他藥物敏感性不同。研究結(jié)果為豬沙門菌病臨床診斷與防治提供了重要依據(jù)。

豬；沙門菌；分離鑒定；藥敏試驗

豬源沙門菌的血清型相當(dāng)復(fù)雜，豬沙門菌病主要由豬霍亂沙門菌(S.cholerasuis)、豬霍亂沙門菌Kunzendorf變型、豬傷寒沙門菌(S.typhisuis)、豬傷寒沙門菌Voldagsen變型、 鼠傷寒沙門菌(S.typhimurirum)、德爾陴沙門菌(S.derby)和腸炎沙門菌(S.enteritidis)等血清型引起[1]。 豬沙門菌病又稱為仔豬副傷寒，臨床上分為急性(敗血型)、亞急性和慢性。本病常引起較高的病死率,其中敗血型病死率達90%,慢性型病死率達25%～50%[2]。近年來，豬場仔豬副傷寒發(fā)病率呈上升趨勢，葉潤全等[3]報道從佛山周邊地區(qū)送檢獸醫(yī)院門診168份可疑病例中，經(jīng)病原分離鑒定，分離到沙門菌51例，分離率達30.4%；據(jù)報道[4]，上海寶山地區(qū)養(yǎng)豬場衛(wèi)生管理規(guī)范、飼養(yǎng)環(huán)境較好的豬場，豬霍亂沙門菌血清陽性率就低(10%)，而比較臟亂差且飼養(yǎng)密度大的豬場陽性率就高(可達75%)。由于豬沙門菌血清型眾多，加之豬場不重視仔豬副傷寒的免疫，獸醫(yī)臨床濫用抗生素，因此仔豬副傷寒報道病例[5-9]較多在所難免，應(yīng)引起重視。為弄清河南2個豬場保育仔豬急性死亡病因，總結(jié)臨床經(jīng)驗，區(qū)別豬瘟、豬藍耳病或豬鏈球菌病，開展了本次研究，為豬沙門菌病的診斷與防控提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集河南2個豬場保育仔豬急性死亡典型病例的病料；臨床上，均表現(xiàn)為呼吸困難，咳嗽，精神不振，皮膚紫紅色斑點，體溫升高，后期拉稀，使用過氟苯尼考、替米考星等藥物，療效不佳，病死率50%～60%；病變?yōu)榉闻K出血點，有的肝臟有一層纖維素性薄膜覆蓋，并且有白色壞死點，腹股溝淺淋巴結(jié)腫大出血，腸系膜淋巴結(jié)索狀腫大，膽汁充盈。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂及SS瓊脂均為北京奧博星有限責(zé)任公司產(chǎn)品；50 mL/L綿羊鮮血瓊脂平板為鄭州博賽生物有限公司產(chǎn)品；TSA(胰蛋白大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白大豆肉湯)為美國BD(Becton,dickinson and company)公司產(chǎn)品；MH瓊脂為英國Oxoid公司產(chǎn)品；TSA平板、TSB肉湯配制時，分別添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(縮寫NAD，終濃度為10 mg/L)和犢牛血清(終濃度50 mL/L)。

1.1.3 藥敏片 卡那霉素(K)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)，氨芐西林(AMP)，阿莫西林-克拉維酸(AMC)，頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑林(KZ)，頭孢曲松(CRO)，美羅培南(MEM)、亞胺培南(IPM)，氨曲南(ATM)，四環(huán)素(TE)、土霉素(OT)，多黏菌素B(PB)，氯霉素(C)，恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)，磺胺甲惡唑(SXT)/甲氧芐啶、磺胺異惡唑(SF)、呋喃妥因(F)，均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.4 其他主要試劑 犢牛血清為杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品；NAD為Roche公司產(chǎn)品，使用前均需過濾除菌；2×TaqPCR Master Mix為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;各種生化試管均為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;大腸埃希菌ATCC25922質(zhì)控菌株由揚州大學(xué)人獸共患病學(xué)江蘇省重點實驗室惠贈；麥氏比濁管為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病菌分離、純化 無菌采集典型病例的心血、肺臟、肝臟，分別接種于TSA平板(加有犢牛血清、NAD)、5%綿羊血瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂，37℃恒溫箱，培養(yǎng)24 h～48 h，進一步用相同培養(yǎng)基純化傳代2～3次；然后將純化的分離菌接種于SS瓊脂平板，挑取單個菌落保存在20%的無菌甘油中，然后放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色鏡檢 將純化的分離菌，革蘭染色，顯微鏡下觀察細菌形狀和大小。

1.2.3 PCR鑒定 按照參考文獻[11]設(shè)計一對引物，上游引物Sal1:5′-CAGGATACCTATAGTGCTGC-3′，下游引物Sal2：5′-CGCACCGTCAAAGGAACCGT-3。將純化后的分離菌，接種TSB肉湯增菌后，用煮沸法提取細菌的DNA，作為PCR反應(yīng)模板。PCR體系為25 μL，擴增程序為94℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L凝膠電泳檢測，若與預(yù)期條帶580 bp左右一致，即為陽性。

1.2.4 生化試驗 按照生產(chǎn)廠家說明書操作。

1.2.5 小鼠致病性試驗 將分離菌在普通營養(yǎng)瓊脂復(fù)活培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落，無菌接種于營養(yǎng)肉湯，37℃過夜培養(yǎng)，使用營養(yǎng)肉湯將其稀釋為5×108CFU/mL菌液,每只小鼠腹腔接種0.2 mL，共接種4只；同時選擇4只小鼠作為對照組，每只小鼠腹腔接種無菌營養(yǎng)肉湯0.2 mL。接種后，觀察1周，記錄接種后小鼠臨床表現(xiàn)。

1.2.6 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會 (Clinical and laboratory standards institute,CLSI)手冊進行藥敏試驗[12]，以E.coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，測定分離菌株的藥物敏感性。首先將保存于-80℃分離菌在普通培養(yǎng)基上劃線復(fù)活，培養(yǎng)18 h～24 h，挑取培養(yǎng)好的單個菌落4～6個，接種于5 mL肉湯中，放置搖床，37℃恒溫，振蕩培養(yǎng)2 h～6 h；然后取出，對比0.5和1.0麥氏比濁管，使菌懸液的濃度在二者之間且更接近于0.5麥氏比濁管的濃度，若濃度偏高可用無菌肉湯進行稀釋；將稀釋好的培養(yǎng)菌懸液在15 min內(nèi)，用無菌棉簽均勻涂于MH培養(yǎng)基上，重復(fù)兩遍；然后將藥敏片貼于其表面；將貼有藥敏片的平板15 min內(nèi)，放于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)16 h～18 h，取出后用直尺測量其直徑。

2 結(jié)果

2.1 分離、培養(yǎng)特征

無菌采集心血、肺臟或者肝臟，分別接種于TSA平板(加有犢牛血清、NAD)、50 mL/L綿羊鮮血瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后，在同一種培養(yǎng)基上均能生長為相似菌落，純化后，37℃培養(yǎng)24 h，在50 g/L綿羊血瓊脂平板生長為無色透明、圓形、邊緣整齊、濕潤的大小約為0.5 mm～2 mm菌落，菌臺生長為奶油狀；分別純化后，接種于SS瓊脂平板，HenanSep1生長為無色透明、細小、圓形、光滑、中央無黑色點菌落，HenanSq2N生長為無色透明、細小、圓形、光滑、中央為黑色小點菌落。

2.2 染色、鏡檢

革蘭氏染色，顯微鏡下觀察到2株分離菌，均為革蘭陰性、桿狀、中等大小(圖1和圖2)。

2.3 PCR鑒定

將分離的2株疑似沙門菌復(fù)活，TSB增菌培養(yǎng)后，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，結(jié)果表明PCR擴增大小為于500 bp～750 bp(圖3)，與預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物片段580 bp大小一致，表明2株分離菌均為沙門菌。

2.4 生化試驗

生化試驗結(jié)果符合沙門菌生化特征，因此將2株分離菌鑒定為沙門菌(表1)。

表1 生化試驗結(jié)果

注:“ +” 產(chǎn)酸 ;“ -” 陰性;“⊕” 產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

Note：“ +”Acid production ;“ -” Negative;“⊕”Acid and gas production.

2.5 小鼠致病性試驗

接種HenanSep1菌10 h后開始出現(xiàn)臨床癥狀，接種HenanSq2N菌16 h開始出現(xiàn)臨床癥狀，均表現(xiàn)為精神不振、蹲伏、不愿活動、毛蓬松、怕冷、不愿采食等，持續(xù)觀察1周無死亡，但是逐漸消瘦；而對照組，4只小鼠均活潑亂跳，無臨床表現(xiàn)。結(jié)果表明2株沙門菌對小鼠均具有致病性。

2.6 藥敏試驗

將分離保存的2株沙門菌分別做藥敏試驗(表2)。2株沙門菌對頭孢噻呋、氨芐西林、氯霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、磺胺異惡唑抑菌圈為零，屬于完全耐藥，同時對恩諾沙星也耐藥；對美羅培南、亞胺培南、氨曲南、頭孢曲松、多粘菌素B、土霉素等敏感，對其他藥物敏感性不同。

3 討論

自1885年Salmon等分離得到豬霍亂沙門菌以來,目前已檢出沙門菌血清型2 500余種,我國已有292個血清型報道[13]。沙門菌在自然界中十分普遍，是一種條件致病菌，對家養(yǎng)畜禽健康、人類公共安全、食品安全都具有嚴重的影響，是一種重要的人獸共患病病原。豬可感染多個血清型，除豬霍亂沙門菌和鼠傷寒沙門菌外，很少有其他血清型能引起臨床發(fā)病，但這些對豬非致病性的血清型可造成豬肉產(chǎn)品的感染，在公共衛(wèi)生上具有重要意義[14]。本研究中，2例仔豬發(fā)病，分別采集典型病例的心血、肺臟、肝臟，接種各種培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，在相同培養(yǎng)基上均能生長為同一種類型菌落，推測在典型病例的心血、肺臟以及肝臟中，均存在這種病原菌，通過常規(guī)鑒定、生化鑒定、PCR鑒定，確定為沙門菌，小鼠致病性試驗具有致病性，結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，將兩次病例確診為仔豬副傷寒。

表2 藥敏試驗結(jié)果

注：S.敏感；I.中介 ；R.耐藥。

Note:S.Sensitive；I.Intermediary ； R.Resistance.

仔豬副傷寒臨床上，很容易與豬藍耳病、豬瘟、豬鏈球菌病、急性胸膜肺炎、副豬嗜血桿菌病等病混淆，導(dǎo)致誤診。孫華偉等[9]報道一起肥育豬沙門菌病被誤診為豬藍耳病的病例，反映出基層散養(yǎng)戶普遍存在一個誤區(qū)，即只要豬耳朵出現(xiàn)發(fā)紺就懷疑是豬藍耳病，豬沙門菌病作為老病和二類動物傳染病不被重視。本研究為了確診病例是否存在副豬嗜血桿菌或者而傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染，選擇了這兩種菌能生長的TSA平板(加有犢牛血清、NAD)培養(yǎng)，但是均未培養(yǎng)出相應(yīng)的病菌。

藥敏試驗表明，2株沙門菌對獸醫(yī)臨床上常用藥物頭孢噻呋、氨芐西林、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、磺胺異惡唑、恩諾沙星均耐藥，但對人用藥物美羅培南、亞胺培南、氨曲南、頭孢曲松敏感性好；然而獸醫(yī)臨床禁止使用藥物氯霉素也完全耐藥，推測與獸醫(yī)臨床長期使用氯霉素類藥物氟苯尼考有關(guān)，據(jù)養(yǎng)殖戶反應(yīng)上述兩次病例中，均使用過氟苯尼考、替米考星等藥物治療，但是無效，病死率依舊高達50%～60%；2株沙門菌對土霉素、多黏菌素敏感，提示臨床上可嘗試選用這兩種藥物治療仔豬副傷寒。本研究結(jié)果表明對氨芐西林100%耐藥，對碳青霉烯類美羅培南、亞胺培南敏感，與文獻報道一致[10]，提示臨床上治療仔豬副傷寒選擇氨芐西林要謹慎。

對豬沙門菌防控最關(guān)鍵的是良好的飼養(yǎng)管理,對豬舍嚴格消毒，改善飼養(yǎng)管理與環(huán)境衛(wèi)生、減少豬應(yīng)激，對飲水、飼料等均應(yīng)執(zhí)行嚴格的獸醫(yī)衛(wèi)生管理，提高豬體自身免疫力，才能有利于控制沙門菌病的暴發(fā)，特別是季節(jié)交替，天氣驟變，長途運輸?shù)葠毫忧闆r下仔豬的預(yù)防更為重要。對于季節(jié)更替和仔豬斷奶前后，可選擇合適仔豬副傷寒疫苗免疫。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：122.

[2] 潘 蕎,鄧治邦.仔豬副傷寒沙門菌致病性及耐藥機制研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2009,30( 2):93 -97.

[3] 葉潤全，陳偉明.佛山市周邊地區(qū)仔豬副傷寒的發(fā)病情況調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011(12)：114-115.

[4] 金明華.寶山地區(qū)豬沙門氏病流行調(diào)查[B].上海：上海交通大學(xué)，2010.

[5] 楊貴樹，李精華，羅發(fā)高,等.豬副傷寒細菌分離與鑒定[J].云南大學(xué)學(xué)報,2008,23(5):713-714.

[6] 劉俊偉，張海棠，張志鵬,等.規(guī)?；i場豬霍亂沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,40( 4):146-148.

[7] 張文波，李宏睿，冷 闖,等.豬源鼠傷寒沙門菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2012，33(11):130-133.

[8] 林 光.豬沙門氏菌病的診斷和防治[J].當(dāng)代畜牧，2013(7)：14.

[9] 孫華偉，張敬峰，趙永前,等.一起肥育豬沙門氏菌病被誤診為藍耳病的反思[J].養(yǎng)豬，2015(5)：115-116.

[10] 加春生，毛澤明，王曉楠,等.沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，45(8):49-54 .

[11] Chiu C H,Ou J T.Rapid identification ofSalmonellaserovars in feces by specific detection of virulence genes,invA and spvC,by an enrichment broth culture-multiplex PCR combination assay[J].J Clin Microbiol,1996,34(10):2619-2622.

[13] 彭海濱.我國沙門菌污染分布概況[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2006,29( 2):125-128.

[14] 劉芹防，崔尚金.豬沙門氏菌病病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷及防治進展[J].豬業(yè)科學(xué)，2009(12)：24-28.

Isolation,IdentificationandDrugResistanceAnalysisofSalmonellaIsolatesfromPiglets

JIANG Zeng-hai1,2,XU Yao-hui1,2，DENG Tong-wei1,2,ZHAO Pan-deng1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan,450046,China；2.HenanEngineeringandTechnologyResearchCenterofVeterinaryBiotechnology,Zhengzhou,Henan,450046,China)

In order to clarify the etiology of two cases of swine diseases,we collected the heart blood,lung and liver from diseased or dead piglets in two pig farms located in Henan province,China in September 2105 and October 2106.TwoSalmonellaisolates were obtained by the conventional isolation,PCR identification and biochemical identification,being named asSalmonellaHenanSep1 andSalmonellaHenanSq2N respectivly.The result of pathogenicity test in mice indicated that all of mice were sick rather than dead after inoculation with 0.2 mL 5×108CFU/mL concentration of 2Salmonellaisolates.Antimicrobial susceptibility of 2Salmonellaisolates was determined using 21 drugs by Kirby-Bauer method.The results showed that both of 2Salmonellaisolates were resistant to ceftiofur,ampicillin,sulfamethoxazole/trimethoprim,sulfamethoxazole,chloramphenicol,and enrofloxacin,being sensitive to meropenem,imipenem,aztreonam,polymyxin B,and oxytetracycline.This study provided an important basis for the clinical diagnosis and prevention of swine salmonellosis.

pigs;Salmonella; isolation and identification; antimicrobial susceptibility test

2017-03-04

河南省科技攻關(guān)計劃項目(162102110144)；江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室開放課題(R1407)；河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目(MXK2016102)

蔣增海(1976-)，男，四川簡陽人，講師，博士，主要從事豬病原微生物學(xué)研究。*

S852.612

B

1007-5038(2017)11-0121-05