曹建文，王宏偉，張雪飛，谷 振，周變?nèi)A

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471000)

益生菌對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染雞保護(hù)效果研究

曹建文，王宏偉*，張雪飛，谷 振，周變?nèi)A

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471000)

接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)孢子化卵囊和益生菌，以血便記分、存活率、體增重和抗球蟲(chóng)指數(shù)為指標(biāo)，探討益生菌的抗球蟲(chóng)活性。在接種第7天后檢測(cè)結(jié)果顯示，益生菌抗球蟲(chóng)指數(shù)為137，能降低球蟲(chóng)感染雞的血便記分，減輕雞盲腸組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的損傷，提高球蟲(chóng)感染雞體增重和存活率，提示益生菌可以輔助應(yīng)用于臨床球蟲(chóng)病的防治。

益生菌；柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；雞；抗球蟲(chóng)指數(shù)；盲腸

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬球蟲(chóng)引起的一種腸道寄生原蟲(chóng)病[1]。本病呈全球性分布，在養(yǎng)禽業(yè)中普遍存在且死亡率高，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[2]。雞球蟲(chóng)的生活史包括體外和體內(nèi)兩個(gè)時(shí)期，三個(gè)生殖階段。孢子生殖階段一般在體外有充足的氧氣和水分的環(huán)境下進(jìn)行，而裂殖生殖階段和配子生殖階段在體內(nèi)進(jìn)行。其中裂殖生殖階段球蟲(chóng)可對(duì)宿主腸道造成嚴(yán)重的病理學(xué)損傷[1,3-4]。雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病是因雞感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriatenella)所致的一種以盲腸病變?yōu)橹鞯脑x(chóng)病。目前雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病主要依靠藥物預(yù)防，由于球蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生，迫切需要尋求新的抗球蟲(chóng)方法[1,3-4]。益生菌是一類(lèi)定植于人和動(dòng)物腸道內(nèi)，具有改善宿主腸道微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性微生物[5]。大量的研究證實(shí)，益生菌具有維持動(dòng)物消化道黏膜菌群平衡，抵御病原微生物入侵，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分，改善腸道黏膜免疫功能的作用[5-7]。在動(dòng)物生產(chǎn)中添加益生菌，可有效提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，為動(dòng)物機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)，提高飼料消耗率，增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力，預(yù)防及治療疾病[7-9]。本研究通過(guò)建立雞E.tenella感染模型，通過(guò)口服接種益生菌，探究了益生菌對(duì)E.tenella感染雞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用雞 200只1日齡海蘭褐商品代蛋公雛購(gòu)自洛陽(yáng)公華禽業(yè)有限公司。試驗(yàn)在河南科技大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)期間執(zhí)行嚴(yán)格的消毒制度，確保試驗(yàn)在無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)用球蟲(chóng)卵囊和益生菌E.tenella孢子化卵囊，由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。益生菌由河南科技大學(xué)環(huán)境與畜產(chǎn)品安全河南省高校重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室保存?？莶菅堪麠U菌，每克2 000億菌數(shù)，有效物質(zhì)含量99.0%；鼠李糖乳桿菌，每克1 000億菌數(shù)，有效物質(zhì)含量98.0%。酵母菌，每克200億菌數(shù)，有效物質(zhì)含量高達(dá)99.0%。試驗(yàn)前進(jìn)行益生菌的活化，并將其稀釋到10×使用濃度，備用。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 在實(shí)驗(yàn)雞飼養(yǎng)至14日齡時(shí)，選取80只體重均勻的雞(100 g±3.76 g)，按體重隨機(jī)分為4組，每組20只。分別為對(duì)照組、益生菌組、感染組、感染加益生菌組。

1.2.2 球蟲(chóng)感染和處理方法 分組完成后，各組進(jìn)行如下處理(表1)。試驗(yàn)期間注意觀察各組雞的精神狀況、血便排出及死亡情況，并做相關(guān)記錄，試驗(yàn)期為7 d。

1.2.3 抗球蟲(chóng)效果評(píng)價(jià) 在試驗(yàn)處理第7天時(shí)，各組雞稱(chēng)重后，進(jìn)行撲殺，采集盲腸組織，進(jìn)行盲腸病變記分，采集盲腸內(nèi)容物進(jìn)行卵囊OPG的測(cè)定，衡量抗球蟲(chóng)ACI值。同時(shí)采用40 mL/L的多聚甲醛對(duì)盲腸組織進(jìn)行固定，HE染色觀察盲腸結(jié)構(gòu)的變化。

相對(duì)增重率 = 益生菌組或者感染組增重/對(duì)照組增重×100%

增重=試驗(yàn)平均末重—試驗(yàn)平均初重

盲腸病變值按Johnson和Reid的0～4分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)盲腸病變記分[10]，盲腸病變值 = 盲腸病變平均記分×10。

糞便記分按Morehouse和Baron的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[11]。

存活率=1-死亡率(僅為球蟲(chóng)感染導(dǎo)致的死亡)。

死亡率=試驗(yàn)開(kāi)始雞的數(shù)量—試驗(yàn)?zāi)┢陔u的數(shù)量/試驗(yàn)開(kāi)始雞的數(shù)量×100%

卵囊值的測(cè)定，取各組盲腸內(nèi)容物，充分混勻、稱(chēng)重，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)每克糞便的卵囊數(shù)(OPG)，按表2換算成卵囊值。

表1 試驗(yàn)分組及處理

表2 OPG值與卵囊值的換算

抗球蟲(chóng)指數(shù)ACI值 =(相對(duì)增重+存活率)—(病變值+卵囊值)，ACI在120以下為無(wú)效；在120～160為低效；在160～180為中效；在180以上為高效。

1.2.4 盲腸組織切片的觀察 采集雞盲腸組織，4%多聚甲醛固定后，制備組織切片，然后進(jìn)行蘇木精和伊紅染色，顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

感染組病雞，初期精神不振，閉目呆立，羽毛蓬松，雙翅下垂，食欲不振，感染第4天可見(jiàn)血便排出。感染加益生菌組相對(duì)感染組有所好轉(zhuǎn)，雞喜采食，血便得到控制。

2.2 益生菌對(duì)柔E.tenella感染雞血便記分的影響

由表3可知，感染組從第4天開(kāi)始排出血便，試驗(yàn)期平均血便記分為2.5。同時(shí)也出現(xiàn)死亡情況。感染加益生菌組排血便情況有所減輕，平均血便記分為1.25。

2.3 益生菌對(duì)E.tenella感染雞存活率的影響

如表4所示，感染組從第4天開(kāi)始，出現(xiàn)雞只死亡情況。感染組和感染加益生菌組雞存活率分別為65%和85%，益生菌的添加顯著降低了球蟲(chóng)感染雞的死亡率。

2.4 益生菌對(duì)E.tenella感染雞體重的影響

由表5所知，感染E.tenella后雞生長(zhǎng)發(fā)育明顯受到了抑制，平均增重為67.7 g，相對(duì)增重率為67.7%，與感染組相比，益生菌的添加提高了雞的平均增重。

2.5 益生菌抗E.tenella感染效果研究

由表6可知，對(duì)照組，益生菌組，感染組和感染加益生菌組抗球蟲(chóng)指數(shù)依次為200、203.9、55.8和137.0，說(shuō)明益生菌的抗球蟲(chóng)感染效果為低效。

表3 不同處理組血便記分

表4 不同處理組雞死亡情況

表5 各組雞體重和體增重

表6 抗球蟲(chóng)指數(shù)

2.6 益生菌對(duì)E.tenella感染雞盲腸組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組(圖1A1，A2和A3)和益生菌(圖1B1、B2和B3)處理組雞盲腸結(jié)構(gòu)正常，腸腺和黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列井然有序，未見(jiàn)明顯的異常變化。E.tenella感染組雞盲腸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，腸固有層出血，腸黏膜脫落，腸腔內(nèi)充滿脫落的腸黏膜及血凝塊，隨處可見(jiàn)散在的球蟲(chóng)卵囊(圖1C1，C2和C3)。感染加益生菌組雞盲腸結(jié)構(gòu)基本完整，腸黏膜和腸腺結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，腸黏膜下層有明顯的出血斑，血塊內(nèi)有散在的球蟲(chóng)卵囊(圖1D1，D2和D3)。

3 討論

雞球蟲(chóng)病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的疾病之一，常呈暴發(fā)性流行[1-3]。目前該病已被美國(guó)農(nóng)業(yè)部列為對(duì)禽類(lèi)危害最嚴(yán)重的五大疾病之一。雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病，是因E.tenella寄生于雞盲腸引起的一種原蟲(chóng)病[4]。本病分布很廣，主要對(duì)2周齡～9周齡的雛雞造成危害，發(fā)病率高達(dá)50%～70%，病死率為20%～30%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80%以上[12]。成年雞感染E.tenella后病死率較低，但會(huì)造成體重和產(chǎn)蛋率下降等現(xiàn)象[2]。本研究通過(guò)口服接種E.tenella孢子化卵囊復(fù)制球蟲(chóng)感染模型，感染組在接種后第4天時(shí)雞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡率為35%。感染加益生菌組與感染組相比降低了雞的死亡率，說(shuō)明益生菌的添加顯著提高了球蟲(chóng)感染雞的存活率。

腸道是機(jī)體接觸各類(lèi)病原微生物、食物毒素和藥物等有害物質(zhì)的直接部位，是病原入侵的重要途徑。完整的腸道屏障是防止腸道內(nèi)有害物質(zhì)和病原體進(jìn)入機(jī)體，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要屏障[6,13]。當(dāng)腸道的正常結(jié)構(gòu)受損時(shí)，腸道中的病原微生物和內(nèi)毒素便可突破腸黏膜屏障，進(jìn)入血液引起消化系統(tǒng)甚至全身性疾病。大量研究表明，臨床上許多疾病的發(fā)生，發(fā)展與轉(zhuǎn)歸都與腸道屏障損傷有關(guān)[14-15]。本研究中，E.tenella感染組雞盲腸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，腸壁固有層呈彌散性出血，腸腺組織模糊不清，腸黏膜脫落，腸腔內(nèi)充滿脫落的腸黏膜及血凝塊，且在腸腔內(nèi)隨處可見(jiàn)散在的球蟲(chóng)卵囊。感染加益生菌組雞盲腸黏膜和腸腺結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，腸黏膜下層有局限性出血，與感染組相比，雞盲腸結(jié)構(gòu)趨于完整。提示添加益生菌可改善E.tenella造成的病理形態(tài)學(xué)損傷，改善雞的腸道微環(huán)境。

A1、A2和A3為對(duì)照組；B1、B2和B3為益生菌組；C1、C2和C3為感染組；D1、D2和D3為感染加益生菌組。

A1，A2 and A3 are from the control group,B1，B2 and B3 are from the probiotics group，C1，C2 and C3 are from the infected group,and D1，D2 and D3 are from the infected and probiotics group.

圖1雞盲腸組織結(jié)構(gòu)的變化

Fig.1 Histooathological changes of cecal tissues in chickens

E.tenella在雞盲腸中繁殖，引起雞盲腸結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致腸消化吸收功能紊亂和體液流失，必然增加腸道內(nèi)條件性致病菌的發(fā)病率[16]。王琪等報(bào)道E.tenella感染可以顯著的增加雞腸炎沙門(mén)菌感染的機(jī)率，而且混合感染對(duì)腸道菌群造成的影響要比單獨(dú)感染更為明顯[16-17]。本研究中添加益生菌雖然只顯示出低效抗球蟲(chóng)作用，但是改善了E.tenella所致的盲腸病理形態(tài)學(xué)變化，顯著提高了感染雞的存活率和平均增重，這可能是因?yàn)樘砑拥囊嫔陔u腸道內(nèi)產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分維持了雞消化道黏膜菌群的平衡，改善了腸道黏膜免疫功能，進(jìn)而發(fā)揮了抗球蟲(chóng)作用。這一研究為益生菌抗球蟲(chóng)研究提供新的思路。

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ProtectiveEffectofProbioticsagainstEimeriatenellaInfectioninChickens

CAO Jian-wen,WANG Hong-wei,ZHANG Xue-fei,GU Zhen,ZHOU Bian-hua

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan,471000,China)

To study the potential effect of probiotics on chickens infected withEimeriatenella,chickens were vaccinated withE.tenellasporulated oocysts and probiotics.The anticoccidial activity of probiotics was evaluated by determining the anticoccidial index,bloody diarrhea score,survival rate and body weight gain in chickens.On the 7thday postinfection,chickens were slaughtered after weighing.The cecal tissues were collected for the histopathological observation by using HE staining.The results showed that anticoccidial index of probiotics was 137,belonging to low efficient anticoccidial agent.But probiotics can decrease bloody diarrhea score in coccidial infected chickens,reduce the histopathological lesions of ceca in chickens,improve chicken body weight gain and survival rate.It can be recommended for the prevention and treatment of clinical coccidiosis.

probiotics;E.tenella; chicken; anticoccidial index; cecum

2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101855)；河南科技大學(xué)SRTP項(xiàng)目(2011046)

曹建文(1992-)，男，山西朔州人，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)的研究。*

S852.723

A

1007-5038(2017)11-0037-05