郭亞洲，馮 柯，王 帥，孫 暾，路 浩，吳晨晨，趙寶玉*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.拉薩市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，西藏拉薩 851000)

西藏天然草地藏橐吾生物堿成分檢測(cè)

郭亞洲1，馮 柯2，王 帥1，孫 暾1，路 浩1，吳晨晨1，趙寶玉1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.拉薩市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，西藏拉薩 851000)

為初步探討藏橐吾地上部分所含生物堿的種類，采用生物堿系統(tǒng)提取法，用薄層色譜、柱層析和GC-MS技術(shù)對(duì)藏橐吾所含生物堿進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，從1.5 kg藏橐吾地上部分提取到酸性氯仿萃取段1.44 g、堿性氯仿萃取段0.81 g、堿性正丁醇段43.64 g，出膏率分別為0.096%、0.054%和2.91%。薄層色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，酸性氯仿萃取段檢測(cè)出2種生物堿，成點(diǎn)性一般；堿性氯仿萃取段檢測(cè)出5種生物堿，成點(diǎn)性好；堿性正丁醇萃取段含有生物堿，成點(diǎn)性差。堿性氯仿萃取段經(jīng)GC-MS檢測(cè)，通過計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)檢索及人工解析，共鑒定出26種化合物，占?jí)A性氯仿萃取段47.08%，其中生物堿有千里光堿、全緣千里光堿、闊葉千里光堿和芥酸酰胺4種，相對(duì)含量分別為0.62%、8.86%、1.98%和2.32%。已鑒定的生物堿為首次從藏橐吾地上萃取段檢出。

藏橐吾；生物堿；千里光堿；全緣千里光堿；西藏天然草地

藏橐吾(Ligulariarumicifolia)隸屬菊科(Compositae)橐吾屬(Ligularia)多年生草本，主要產(chǎn)于我國(guó)西藏東南部至東北部天然草地，生于海拔3700 m～4500 m的林下、湖邊、灌叢及山坡礫石地[1]。近些年來(lái)，受氣候變化、干旱、人口增長(zhǎng)、過度采挖、超負(fù)荷放牧等自然和人為因素影響，西藏天然草地嚴(yán)重退化，導(dǎo)致植物種群結(jié)構(gòu)明顯改變，可食牧草減少，而伴隨大量毒害草滋生，牲畜毒害草中毒災(zāi)害屢見不鮮。王力等[2]報(bào)道我國(guó)天然草地常見橐吾屬植物，如黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)、網(wǎng)脈橐吾(Ligulariadictyoneura)、大黃橐吾(Ligulariaduciformis)、蹄葉橐吾(Ligulariafischeri)和箭葉橐吾(Ligularia.sagitta)等，均全株帶毒；自1979年日本學(xué)者Hikichi M.首次從齒葉橐吾(Ligulariadentata)中檢測(cè)到山崗橐吾堿后，關(guān)于橐吾屬植物中吡咯哩西定生物堿的研究便逐步展開[3]；研究發(fā)現(xiàn)，舟葉橐吾(Ligulariacymbnlifera)、Ligulariamortonii及一種未命名橐吾屬植物均含有肝毒性吡咯里西啶生物堿，是造成分布在不丹境內(nèi)喜馬拉雅邊境地區(qū)牦牛中毒的有毒植物[4]。濮社班等[5]采用薄層色譜法、液相色譜與多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MSn)對(duì)22種橐吾屬植物中的生物堿檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18種橐吾屬植物中含有肝毒性吡咯里西啶生物堿。

目前，藏橐吾已成為我國(guó)西藏高寒草原退化草地常見毒害草中的優(yōu)勢(shì)種群，嚴(yán)重影響草地質(zhì)量，危害畜牧業(yè)發(fā)展[6]。馮柯等[7]根據(jù)小鼠急性毒性試驗(yàn)證實(shí)，藏橐吾有毒，且主要損傷器官為胃腸道、肝臟、脾臟等器官。但是，由于國(guó)內(nèi)外對(duì)藏橐吾化學(xué)成分研究尚屬空白，對(duì)于藏橐吾毒性成分及其毒性機(jī)制還不清楚，且缺乏有效防治牲畜藏橐吾中毒的措施。本試驗(yàn)通過對(duì)藏橐吾地上部分生物堿成分檢測(cè)，初步闡明藏橐吾所含生物堿成分的種類，為進(jìn)一步確證藏橐吾毒性成分及其毒作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物樣品 2015年8月，采集藏橐吾地上部分全草，地點(diǎn)為西藏堆龍德慶(30°02′07.46″N；90°36′26.06″E)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)常朝陽(yáng)研究員鑒定。

1.1.2 儀器與試劑 HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；薄層色譜專用硅膠GF254及柱色譜用硅膠(100-200目和200-300目)，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；DB-2A數(shù)顯電熱板，常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；氯仿等有機(jī)試劑為分析純，四川西隴化工有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 生物堿重點(diǎn)預(yù)試 采用裴月湖主編的《天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中介紹的植物生物堿成分重點(diǎn)預(yù)試方法[8]。在藏橐吾生物堿預(yù)試制備液中加入Dragendoff試劑，若出現(xiàn)橘紅色或黃色沉淀；加入Wagner試劑，出若現(xiàn)棕色或褐色沉淀；加入Hager試劑，若出現(xiàn)黃色沉淀；加入Bertrand試劑，若出現(xiàn)灰白沉淀，則為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.2 藏橐吾生物堿提取 藏橐吾草粉1.5 kg，利用工業(yè)酒精回流提取4 h～6 h后，減壓回收稱量醇浸膏。醇浸膏經(jīng)酸化、堿化處理后，順次加入氯仿和正丁醇分段萃取，得到各萃取段生物堿提取物[9]。準(zhǔn)確稱取各萃取段浸膏質(zhì)量，計(jì)算出膏率。

1.2.3 生物堿各萃取部位TLC檢測(cè) 分別取酸性氯仿萃取段、堿性氯仿萃取段和堿性正丁醇萃取段，加一定量590 mL/L乙醇溶解，慮去不溶物，點(diǎn)樣于GF254薄層硅膠板，上行法展開，待溶劑前沿距薄層板上端1 cm處取出，用Dragendorff's試劑對(duì)生物堿進(jìn)行專項(xiàng)顯色，并記錄顯色斑點(diǎn)顏色，計(jì)算比移值[10]。

1.2.4 藏橐吾生物堿成分GC-MS檢測(cè) 將生物堿顯色清楚、成點(diǎn)性好的堿性氯仿萃取部位經(jīng)柱層析凈化除雜質(zhì)，氯仿甲醇梯度洗脫，分段收集，TLC檢測(cè)，合并含生物堿部分用于GC-MS檢測(cè)(表1)。

表1 藏橐吾生物堿成分GC-MS檢測(cè)條件

2 結(jié)果

2.1 生物堿重點(diǎn)預(yù)試

大多數(shù)生物堿的酸水溶液與生物堿沉淀試劑反應(yīng)，生成有色的弱酸不溶性復(fù)鹽或絡(luò)合物沉淀。藏橐吾地上部分生物堿重點(diǎn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果中，均出現(xiàn)明顯的有色沉淀，表明藏橐吾地上部分全草中可能含有生物堿成分。

2.2 生物堿提取結(jié)果

1.5 kg藏橐吾地上部分粉末得醇浸膏248.7 g，提取率為16.58%。醇浸膏用適量2%鹽酸酸化，加等量氯仿萃取3次，減壓回收溶劑；用50 g/L NaOH溶液將酸水液調(diào)至pH9～11，分別用氯仿和正丁醇萃取處理。得到酸性氯仿萃取段1.44 g、堿性氯仿萃取段0.81 g、堿性正丁醇萃取段43.64 g，出膏率分別為0.096%、0.054%和2.91%。

2.3 氯仿萃取部位薄層色譜分析結(jié)果

選用11種展開劑系統(tǒng)對(duì)藏橐吾酸性氯仿和堿性氯仿萃取萃取段所含生物堿進(jìn)行TLC分析(表2)。結(jié)果顯示，酸性氯仿萃取段和堿性氯仿萃取段以氯仿∶甲醇+氨水(10∶1+1 d)展開效果最佳，不論是顯色斑點(diǎn)的數(shù)量，還是成點(diǎn)性，都優(yōu)于其他展開劑。改良碘化鉍鉀顯色酸性氯仿萃取段顯出2個(gè)黃色斑點(diǎn)，堿性氯仿萃取段顯出5個(gè)橙黃色斑點(diǎn)(圖1)。

左：生物堿酸性氯仿萃取段；右：生物堿堿性氯仿萃取段

Lift is acidity chloroform extracts; Right is alkaline chloroform extracts

圖1氯仿萃取段最佳展開劑改良碘化必鉀顯色圖

Fig.1 The colored graph of the optimal developer for chloroform extract by Dragendorff's

2.4 堿性正丁醇萃取段薄層色譜分析結(jié)果

藏橐吾堿性正丁醇萃取段經(jīng)二氯甲烷∶甲醇、乙酸乙酯∶甲醇、乙酸乙酯∶正丁醇等多種溶劑系統(tǒng)展開，改良碘化鉍鉀顯色后，均可觀察到明顯橙黃色條帶，但拖尾嚴(yán)重，成點(diǎn)性差。

2.5 堿性氯仿萃取段GC-MS檢測(cè)

根據(jù)薄層色譜分析，發(fā)現(xiàn)堿性氯仿萃取段是生物堿主要集中部位。將其通過硅膠柱層析凈化除雜，氯仿：甲醇梯度洗脫，收集含生物堿組份合并后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)(圖2)。各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)檢索和人工解析，并用面積歸一化法測(cè)定各化合物的相對(duì)含量(表2)。共鑒定出26個(gè)單體化合物，占?jí)A性氯仿萃取段47.08%，其中檢測(cè)出4種生物堿成分，分別是千里光堿、全緣千里光堿、闊葉千里光堿和芥酸酰胺，相對(duì)含量為0.62%、8.86%、1.96%和2.32%，生物堿含量占?jí)A性氯仿萃取段的13.78%。

表2 藏橐吾氯仿萃取段生物堿薄層色譜分析結(jié)果

注： “d”代表1滴。

Note:“d” means a drop.

圖2 堿性氯仿萃取段總離子圖

3 討論

生物堿是一類氮的堿性化合物，多數(shù)具有復(fù)雜的氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，有光學(xué)活性和顯著的生理效應(yīng)[11]。生物堿的發(fā)現(xiàn)始于19世紀(jì)初，是人們研究最早而且最多的一類天然有機(jī)化合物。大多數(shù)生物堿具有顯著生理活性，往往是植物中重要的有效成分或毒性成分，因此一直成為天然產(chǎn)物的重要研究方向。雙稠吡咯啶生物堿(PAs)作為生物堿的一大類群，廣泛存在于多種植物中，迄今為止，PAs已在菊科千里光屬、狗舌草屬、橐吾屬及澤蘭屬，紫草科聚合草屬和天芥菜屬，豆科野百合屬等13個(gè)科植物中檢出，截至目前，從自然界植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)600多種PAs[12]。Cheeke P R等[13]報(bào)道，家畜采食含有PAs植物或其種子，會(huì)導(dǎo)致中毒，且表現(xiàn)肝臟毒性，給草地畜牧業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。此外，有研究表明，PAs還有致癌、致突變和致畸胎毒性，若在動(dòng)物性產(chǎn)品中殘留可影響食品安全。近年，研究者分別從我國(guó)特有的蒼山橐吾(Ligulariatsangcbanensis)、鹿蹄橐吾(Ligulariahodgsonii)、洱源橐吾(Ligularialankongensis)、舟葉橐吾(Ligulariacymbulifera)、剛毛橐吾(Ligulariaachyrotricha)中分離到O-acetylyamataimine、O-acetylyamataimine N-oxide、clivorine、ligularine、lankongensisine A、lankongensisine B、1-((β-D-glucopyranosyloxy)methyl)-5,6-dihydropyrrolizin-7-one和ligulachyroine A等8種雙稠吡咯啶生物堿[14-18]，并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行初步研究，但未對(duì)毒性進(jìn)行說明。王躍虎等[19]在研究菊科狗舌草(Tephroseriskirilowii)毒性時(shí)，發(fā)現(xiàn)生物堿是其主要毒性物質(zhì)，測(cè)得小鼠LD50為75 mg/kg，并采用GC-MS技術(shù)從生物堿中檢測(cè)出千里光堿、千里光非靈、全緣千里光堿、當(dāng)歸酰天芥菜定4種生物堿。王軍等[20]認(rèn)為PAs類生物堿進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，在肝臟代謝成活性代謝物吡咯后產(chǎn)生肝毒性，引起肝細(xì)胞出血性壞死、肝巨紅細(xì)胞癥及靜脈閉塞癥等。藏橐吾作為西藏高寒草原主要優(yōu)勢(shì)毒害草，嚴(yán)重影響草地畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)安全質(zhì)量，但目前有關(guān)藏橐吾的研究?jī)H限于生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)分布等，而其化學(xué)成分，尤其是毒性成分及其毒性機(jī)制的研究尚屬空白[6]。

表2 堿性氯仿萃取段GC-MS檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)資料以及課題組對(duì)藏橐吾急性毒性研究的基礎(chǔ)上，對(duì)藏橐吾所含生物堿成分進(jìn)行確定。從1.5 kg藏橐吾地上部分全草得到酸性氯仿萃取段1.44 g、堿性氯仿萃取段0.81 g、堿性正丁醇萃取段43.64 g，出膏率分別為0.096%、0.054%和2.91%。薄層色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，酸性氯仿萃取段、堿性氯仿萃取段和堿性正丁醇萃取段均含有生物堿，但根據(jù)呈現(xiàn)斑點(diǎn)的數(shù)量和成點(diǎn)性判斷，堿性氯仿萃取段檢測(cè)出5種生物堿，且成點(diǎn)性好；GC-MS檢測(cè)從堿性氯仿萃取段鑒定出千里光堿、全緣千里光堿、闊葉千里光堿和芥酸酰胺4種生物堿，相對(duì)含量分別為0.62%、8.86%、1.96%和2.32%。結(jié)果表明，從藏橐吾全草中檢測(cè)出的4種生物堿相對(duì)含量占?jí)A性氯仿萃取段的13.78%，是首次從藏橐吾中發(fā)現(xiàn)Pas類生物堿，豐富了藏橐吾化學(xué)成分的研究?jī)?nèi)容。結(jié)合課題組對(duì)藏橐吾小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果[7]，初步判斷高含量的肝毒性吡咯里西啶生物堿可能是藏橐吾引起家畜中毒的主要毒性成分之一。在此基礎(chǔ)上，課題組還將對(duì)藏橐吾所含生物堿成分進(jìn)行專項(xiàng)分離，利用1H-NMR、13C-NMR、IR、MS等光譜手段對(duì)所分離生物堿單體化合物進(jìn)行鑒定。并且通過體內(nèi)、體外試驗(yàn)研究生物堿的毒性作用機(jī)制，為藏橐吾毒理學(xué)研究提供理論依據(jù)，為制定科學(xué)有效的防控措施及解毒方案具有重要意義。

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AnalysisofAlkaloidcomponentsLigulariarumicifoliainNaturalGrasslandofTibet

GUO Ya-zhou1,FENG Ke2,WANG Shuai1,SUN Tun1,LU Hao1,WU Chen-chen1,ZHAO Bao-yu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China; 2LhasaCityAnimalDiseasePreventionControlCenter,Lhasa,Tibet,851000,China)

In order to determine alkaloids in the aerial parts ofLigulariarumicifolia,this study adopted systemic extraction for alkaloid.We isolated and measured alkaloids from the aerial parts ofL.rumicifoliaby TLC,column chromatography and GC-MS.The results were as follows:The weights in the parts of acidity chloroform,alkaline chloroform and alkaline n-butyl alcohol were 1.44 g,0.81 g and 43.64 g from the aerial parts ofLigulariarumicifolia(1.5 kg),the rates were 0.096%，0.054% and 2.91%% respectively.By TLC,there are 2 alkaloids in acidity chloroform and 5 alkaloids in alkaline chloroform.However,in alkaline n-butyl alcohol,we found alkaloids,but the variety is unclear.By GC-MS,26 components were identified,accounting for 47.06% of the total contents of the part of chloroform.4 alkaloids were identified,which are senecionine(0.62%),integerrimine(8.86%),platyphylline(1.98%) and erucamide(2.32%).Alkaloids were identified for the first time from the aerial parts ofLigulariarumicifolia.

Ligulariarumicifolia; alkaloid; senecionine; integerrimine; natural grassland of Tibet

2017-05-17

農(nóng)業(yè)部“十二五”公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203062)

郭亞洲(1990- )，男，碩士研究生，主要從事動(dòng)物中毒病與毒理學(xué)研究。*

S859.87

A

1007-5038(2017)11-0071-05