張智鵬

(漢中市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，陜西漢中 723000)

抗凝劑對動(dòng)物布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)的影響

張智鵬

(漢中市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，陜西漢中 723000)

為探討含抗凝劑樣品對動(dòng)物布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)的影響，采集豬、牛、羊等不同動(dòng)物的血液各10份，經(jīng)檸檬酸鈉、EDTA、肝素鈉等抗凝劑處理后與對應(yīng)的自然凝固、立即離心獲得的樣品分別進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，比較兩種試驗(yàn)結(jié)果的差異。結(jié)果顯示，經(jīng)抗凝劑處理后的血漿樣品虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，試管凝集試驗(yàn)均為陰性，而自然凝固的血清樣品兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，不同處理方式造成的虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果差異現(xiàn)象不受動(dòng)物種類的影響?？鼓齽⒓t平板凝集試驗(yàn)影響非常顯著，對試管凝集試驗(yàn)無影響。因此，臨床上用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行動(dòng)物布魯菌病篩查時(shí)，不能使用含有抗凝劑的血液樣品，否則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性凝集現(xiàn)象。

布魯菌?。豢鼓齽?；虎紅平板凝集試驗(yàn)；試管凝集試驗(yàn)

布魯菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由布魯菌引起的人畜共患傳染病[1-2]，不僅可造成易感動(dòng)物流產(chǎn)、不孕、關(guān)節(jié)炎、睪丸炎等，降低種畜利用價(jià)值，并長期帶菌，成為危險(xiǎn)的傳染源，還可通過直接或間接接觸向人際間傳播，引起人關(guān)節(jié)和肌肉疼痛、肝脾腫大、睪丸炎、附睪炎、孕婦流產(chǎn)、不孕等癥狀，嚴(yán)重者可喪失勞動(dòng)能力[3-5]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將布魯菌病列為必須 的傳染病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。

虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)是布病監(jiān)測及診斷使用最廣泛的兩種檢驗(yàn)方法[6]，被列入我國《動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)》[7],成為法定的檢驗(yàn)方法。在實(shí)際檢測過程中，虎紅平板凝集試驗(yàn)常作為動(dòng)物布病的田間篩查，結(jié)果陽性的樣品再用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行定性確診[8-9]。許多試驗(yàn)結(jié)果表明，虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)結(jié)果符合率超過90%[10-11]，而虎紅平板凝集試驗(yàn)具有用時(shí)短、操作簡便、靈敏度高等特點(diǎn)，被許多動(dòng)物疫病監(jiān)測機(jī)構(gòu)用于布病樣品的初篩。漢中市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)多年開展豬、牛、羊等動(dòng)物布病的監(jiān)測、凈化工作，在檢測中發(fā)現(xiàn)，使用抗凝劑的樣品會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性凝集現(xiàn)象，所有樣品均呈現(xiàn)凝集狀態(tài)，而試管凝集試驗(yàn)結(jié)果又全為陰性。為掌握其凝集機(jī)理，避免誤診和提高布病監(jiān)測工作效率，筆者開展了抗凝劑對布病虎紅平板凝集試驗(yàn)影響的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 漢中市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室布病檢測陰性樣品20份，其中牛、羊樣品各10份；采集豬、牛、羊全血各10份，每份血樣10 mL，平均分成5組，即每組有豬、牛、羊血樣各10份，每份2 mL。每個(gè)畜種每份全血的3組血樣分別按要求加入檸檬酸鈉、肝素鈉和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 3種抗凝劑，充分混勻，3 000 r/min，離心10 min，取上清液編號(hào)備用；第四組血樣通過靜置、自然凝固、離心等過程制備血清，編號(hào)順序同抗凝血樣品；第五組血樣在采集后立即離心，吸取上清液編號(hào)備用，編號(hào)順序同抗凝血樣品。

1.1.2 試劑 布魯菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào)20150705)、布魯菌病試管凝集試驗(yàn)抗原(20150703)，青島異邦生物工程有限公司產(chǎn)品；檸檬酸鈉、EDTA-Na2，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；肝素鈉，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；抗凝劑的配制及使用：分別配制檸檬酸鈉、肝素鈉和EDTA-Na2抗凝劑，檸檬酸鈉3 g，檸檬酸1 g，葡萄糖2.5 g，加水至100 mL，抗凝劑與血液比例為1∶9；肝素鈉用超純水配成1 mg/mL水溶液，抗凝劑與血液比例為1∶10； EDTA鹽配成150 mg/mL的水溶液，每5 mL血液加0.04 mL EDTA-Na2溶液。

1.1.3 儀器、耗材 離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，加樣器，一次性真空采血器、載玻片。

1.2 方法

虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)操作步驟及判定標(biāo)準(zhǔn)按照《動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646-2002)進(jìn)行 。

1.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn) 將配制的抗凝劑溶液按規(guī)定的劑量加入到已知陰性血清中，進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 抗凝劑對不同畜種布魯菌病檢測結(jié)果的影響 不同畜種的加抗凝劑樣品分別進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，比較抗凝劑對不同畜種布病檢測結(jié)果的影響。

1.2.3 加抗凝劑樣品與對應(yīng)的自然凝固樣品 加抗凝劑樣品與對應(yīng)的自然凝固樣品進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，比較兩種樣品檢測結(jié)果的差異。

1.2.4 加抗凝劑樣品與對應(yīng)的立即離心樣品 加抗凝劑樣品與對應(yīng)的立即離心樣品進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，比較兩種樣品檢測結(jié)果的差異。

2 結(jié)果

2.1 陰性血清樣品中加抗凝劑對RBPT的影響

在已知血清中加入規(guī)定劑量的抗凝劑，20份血清樣品的檢測結(jié)果仍為陰性(表1)，結(jié)果沒有發(fā)生變化，說明抗凝劑不能改變抗體特性或成為非特異性抗體與布病虎紅試劑發(fā)生凝集反應(yīng)的橋梁。

表1 陰性血清中直接加抗凝劑的RBPT試驗(yàn)結(jié)果

注：N.牛血清；Y.羊血清。

Note：N.Cattle serum;Y.Goat serum.

2.2 不同畜種加抗凝劑樣品的RBPT、SAT試驗(yàn)結(jié)果

不同的畜種在全血中加入抗凝劑，處理后的樣品試驗(yàn)結(jié)果一致(表2)。RBPT全部呈現(xiàn)凝集狀態(tài)，而SAT結(jié)果均不凝集。說明在全血中加入抗凝劑后對不同畜種影響無差異，但都能導(dǎo)致RBPT出現(xiàn)非特異性凝集，對SAT結(jié)果無影響。

2.3 加抗凝劑樣品與自然凝固樣品的RBPT、SAT試驗(yàn)結(jié)果

兩種樣品試驗(yàn)結(jié)果SAT均不凝集，加抗凝劑樣品的RBPT全部凝集，而自然凝固樣品的RBPT不凝集(表3)。說明加入抗凝劑后改變了樣品的特性，成分中出現(xiàn)使RBPT結(jié)果由不凝集變成凝集的因素，這個(gè)因素對SAT沒有影響。

表2 不同畜種加抗凝劑樣品檢測結(jié)果

注：Z.豬血清; N.牛血清; Y.羊血清。

Note：Z.Pig serum; N.Cattle serum; Y.Goat serum.

2.4 加抗凝劑樣品與立即離心樣品的RBPT、SAT試驗(yàn)結(jié)果

兩種樣品的試驗(yàn)結(jié)果均一致，RBPT都凝集，而SAT都不凝集(表4)，說明兩種處理方式的樣品都具有導(dǎo)致RBPT試驗(yàn)?zāi)某煞帧?/p>

表3 加抗凝劑樣品與自然凝固樣品檢測結(jié)果

注：Z.豬血清; N.牛血清; Y.羊血清。

Note：Z.Pig serum; N.Cattle serum; Y.Goat serum.

3 討論

根據(jù)《動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)》和布魯菌病虎紅平板凝集抗原使用說明書的規(guī)定，RBPT所用的樣品應(yīng)為血清，并要求血清新鮮，無明顯蛋白凝塊。在實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)，部分動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)及養(yǎng)殖場技術(shù)人員由于采血技術(shù)不熟練，血清分離不規(guī)范，導(dǎo)致血清量少，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的樣品份數(shù)多，有效樣品數(shù)少。為按時(shí)完成采樣、檢測任務(wù)，就會(huì)采用血液中添加抗凝劑或采血后立即離心等方法以獲得外觀表現(xiàn)好、數(shù)量多的樣品。通過血液的成分分析，經(jīng)這兩種方式處理后的樣品，是除去血細(xì)胞和血小板后剩余的血漿，即試驗(yàn)操作人員把血漿代替血清用于RBPT試驗(yàn)。血漿樣品在其他動(dòng)物疫病檢測中還沒有發(fā)現(xiàn)明顯的非特異性反應(yīng)，但可造成RBPT出現(xiàn)顯著的假陽性結(jié)果，影響試驗(yàn)結(jié)果判定，也大大增加了進(jìn)一步確診的工作量。

表4 加抗凝劑樣品與立即離心品檢測結(jié)果

注：Z.豬血清; N.牛血清; Y.羊血清。

Note：Z.Pig serum; N.Cattle serum; Y.Goat serum.

試驗(yàn)結(jié)果表明，抗凝劑并不能直接引起RBPT非特異性凝集反應(yīng)，血漿和血清的不同成分造成了RBPT的假陽性結(jié)果。這與蒙文娟[12]試驗(yàn)結(jié)果一致。血漿與血清的最大區(qū)別是血漿中含有纖維蛋白原，而血清中沒有。試劑方面，布病RBPT抗原是將抗原性良好的布魯菌，接種適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲菌體，經(jīng)加熱滅活、離心后用虎紅染液染色，懸浮于乳酸緩沖液中制成?；⒓t又叫孟加拉紅，是四氯四碘熒光素，在乳酸緩沖液中帶負(fù)電荷，可與帶正電荷的血漿纖維蛋白原結(jié)合，形成了肉眼可見的非特異性超分子顯色反應(yīng)[13]。這就是抗凝劑干擾布病RBPT檢測結(jié)果的原因。

布魯菌病的檢測方法有許多種，但各有優(yōu)缺點(diǎn)，有的方法操作簡便，敏感性高，但特異性低，準(zhǔn)確率差；有的方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高，但對儀器設(shè)備要求高，操作繁雜，不易掌握，檢測時(shí)間長。在實(shí)際檢測過程中，我們既要考慮檢測方法的特點(diǎn)，又要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，選擇兩種或兩種以上的方法配合使用，相互驗(yàn)證，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，在布魯菌檢測過程中，應(yīng)加強(qiáng)獸醫(yī)人員采樣技術(shù)培訓(xùn)，熟練掌握采血技能，按照要求采集、處理、保存樣品，堅(jiān)決杜絕含有抗凝劑的樣品用于RBPT檢測，確保布病診斷、檢測工作的順利開展。

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EffectofAnticoagulantsonAgglutinationTestofTigerRedPlateinAnimalBrucellosis

ZHANG Zhi-peng

(HanzhongAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Hanzhong,Shaanxi,723000,China)

To investigate the effect of anticoagulant-containing samples on the agglutination test of Rose Bengal plate test(RBPT) in animal brucellosis,10 pig,cattle,goat blood samples were collected.After the treatment with sodium citrate,EDTA-Na2,heparin sodium and other anticoagulants,the samples were obtained by centrifugation with the corresponding natural coagulation and centrifugal samples.The differences between the two test results were compared.After the anticoagulant treatment,the results of RBPT agglutination test were positive,the standard tube agglutination test(STA) agglutination test was negative,and the natural coagulation serum samples of the two test results were negative.The differenttreatment methods did not affect the various animal species by RBPT.The anticoagulant had a significant effect on the RBPT,and had no effect on the STA test.The blood samples containing anticoagulants could not be used when screening with tiger red plate agglutination test.Otherwise,severe non-specific agglutination may occur.

Brucellosis; anticoagulant; RBPT; SAT

2017-05-29

張智鵬(1977-)，男，陜西城固人，高級獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控工作。

S852.614;S854.43

A

1007-5038(2017)11-0132-05