邱璐瑤 平靜 李文道 丁嵩濤 劉含登

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，重慶 400331;2.重慶醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，重慶 400331)

·論著·

3種微孢子蟲在我國西南部分地區(qū)腹瀉患者中的流行情況調(diào)查

邱璐瑤1，2平靜1，2李文道1，2丁嵩濤1劉含登1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，重慶 400331;2.重慶醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，重慶 400331)

目的調(diào)查畢氏腸道微孢子蟲 (Enterocytozoonbieneusi)、腸炎微孢子蟲 (Encephalitozoonintestinalis)和兔腦炎微孢子蟲 (Encephalitozooncuniculi)在我國西南地區(qū)的流行情況。方法收集了124份西南地區(qū)腹瀉患者的糞便，通過顯微鏡鏡檢、PCR檢測等手段，進(jìn)行微孢子蟲的分離與鑒定。結(jié)果畢氏腸道微孢子蟲和腸炎微孢子蟲的檢出率較高，分別為7.26% (9/124)和3.23% (4/124),兔腦炎微孢子蟲的檢出率為0。結(jié)論西南地區(qū)腹瀉患者有感染微孢子蟲的情況，感染類型多為畢氏腸道微孢子蟲和腸炎微孢子蟲。

微孢子蟲；腹瀉患者；感染；人畜共患；PCR檢測

微孢子蟲 (microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的真核微生物，目前學(xué)術(shù)界將其歸于真菌一類，廣泛寄生于無脊椎動物如蜜蜂、蠶和包括人在內(nèi)的幾乎所有種類的脊椎動物中[1]。目前已經(jīng)報(bào)道的微孢子蟲有160個(gè)屬，約1 300種，其中8個(gè)屬中的14個(gè)蟲種可以感染人[2]。畢氏腸道微孢子蟲 (Enterocytozoonbieneusi)和腦炎微孢子蟲屬 (Encephalitozoon)微孢子蟲是感染人和動物最常見的病原體，具有人畜交叉感染的特性，感染者最典型的癥狀是腹瀉。據(jù)Anane等[3]研究表明，阿苯達(dá)唑?qū)δX炎微孢子蟲有效，但對畢氏腸道微孢子蟲 (E.bieneusi)無明顯作用，而氟馬西尼對二者均有效。

1985年，人類第一次在艾滋病患者身上發(fā)現(xiàn)畢氏腸道微孢子蟲的感染[4]，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)一百多種能夠同時(shí)感染人和動物的基因型[5]。目前已報(bào)道的基因型主要分為動物傳染性基因型亞群 (Group 1)和宿主特異性基因型亞群 (Group2-5)。前者主要感染人，后者的宿主多為家畜和野生動物。值得一提的是，Group2中的部分基因型能夠同時(shí)感染人和動物[6]。研究表明，畢氏腸道微孢子蟲不但可以導(dǎo)致免疫功能缺陷者長期的致死性腹瀉，還能夠?qū)е旅庖吖δ苷Ｕ邉×业淖韵扌愿篂a[4]。其主要通過糞口途徑傳播[7]，幾乎可以感染所有動物，尤其是哺乳動物和鳥類。腦炎微孢子蟲中主要有3種類型可以感染人，即兔腦炎微孢子蟲 (Encephalitozooncuniculi)、腸炎微孢子蟲 (Encephalitozoonintestinalis)和海倫腦炎微孢子蟲 (Encephalitozoonhellem)[8]。

近年來，基于ITS 序列的分型方法已廣泛用于微孢子蟲病的流行病學(xué)研究[9]。盡管已在許多不同種類的動物身上檢測到微孢子蟲，但對于微孢子蟲感染人的研究仍然不夠，我國更是鮮有報(bào)道，目前我們對于微孢子蟲的傳播過程并不完全清楚，因此對微孢子蟲的感染現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查很有必要。為此研究者收集了分別來自重慶市和四川省自貢市的糞便樣本，檢測畢氏腸道微孢子蟲 (Enterocytozoonbieneusi)、腸炎微孢子蟲 (Encephalitozoonintestinalis)和兔腦炎微孢子蟲 (Encephalitozooncuniculi)這3種微孢子蟲的感染情況，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

腹瀉患者的糞便來源于四川省自貢市和重慶市，重慶地區(qū)32份糞便樣本全部來自兒童，四川地區(qū)92份糞便樣本有43份來自兒童，35份來自55歲以上的老年人，14份來自其他年齡段。糞便基因組提取試劑盒為QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (50)，貨號為51604，購買于重慶韻博科技公司；PCR試劑為TaKaRa TaqTM，型號R001AM；依據(jù)腸道微孢子蟲核苷酸注釋數(shù)據(jù)庫 (http://microsporidiadb.org/micro/)，利用primer 5.0軟件，分別設(shè)計(jì)一對特異性引物，引物名稱序列以及目的條帶長度見表1，引物合成于上海英駿公司 (Invitrogen)。

1.2 方法

表1 用于PCR檢測的引物序列

顯微鏡鏡檢 糞便中微孢子蟲的顯微鏡下檢測采用改良三色法[10]完成，具體過程為將6.0 g鉻變素2R，0.5 g苯胺藍(lán)，0.7 g磷鎢酸溶解于3 mL冰醋酸中，室溫下放置30 min后，加入100 mL蒸餾水，再加入1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.5。用甲醛固定涂片后，用上述混勻液在37℃下染色30 min后，用酸醇 (4.5 mL乙酸和995.5 mL的95%酒精混合)沖洗10 s，用95%的酒精洗脫10 s并將玻片脫水干燥。在95%的酒精中孵化2次，1次5 min，然后在100%的酒精中孵化10 min，再用二甲苯孵化5 min，封片，鏡下觀察 (×1 000)。

感染腸道微孢子蟲的分離 糞便勻漿經(jīng)滅菌雙蒸水于2 000 r/min離心10 min，直至上清液澄清為止；棄上清，用滅菌雙蒸水懸浮微孢子蟲，500 r/min離心10 min；吸取上清液移至另一離心管中，2 000 r/min離心10 min，棄上清液；用雙蒸水重新懸浮微孢子蟲，500 r/min離心10min，如仍有沉淀，則繼續(xù)用雙蒸水重懸離心，直至無沉淀為止；最后，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀物。

全基因組DNA的提取 利用糞便基因組提取試劑盒[QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (50)]進(jìn)行全基因組提取,操作方法為取1.5 mL的EP管1支，加入200 μL稀便，1 mL InhibitEx Buffer，25 μL蛋白酶K，渦輪混勻15 s。55℃水浴14～16 h后，取出EP管渦輪振蕩1 min，14 000 r/min離心1 min。另取1支新的1.5 mL EP管，向其中加入200 μL離心后的上清液，15 μL蛋白酶K，200 μL AL Buffer，渦輪混勻1 min后70℃水浴10 min。取出水浴鍋中的EP管，加入200 μL無水乙醇，渦輪混勻1 min。小心移取600 μL所得溶解產(chǎn)物到QIAamp離心柱，14 000 r/min離心1 min后將QIAamp離心柱移至1個(gè)新的2 mL收集管中，加入500 μL緩沖液AW1，14 000 r/min離心1 min后，將QIAamp離心柱移1個(gè)至新的2 mL收集管中，加入500 μL緩沖液AW2,14 000 r/min離心3 min。然后將收集管中濾液倒去，14 000 r/min離心3 min。將QIAamp離心柱轉(zhuǎn)移到一支新的1.5 mL EP管，移取200 μL緩沖液ATE至柱上，室溫孵化1 min后，14 000 r/min洗提DNA，所得基因組產(chǎn)物儲存于-20℃冰箱備用。

目的序列的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：基因組DNA加入2 μL，10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/mL)6 μL，dNTP (2.5 mmol/mL)8 μL，正反向引物 (10 μmol/L)各5 μL，Taq酶 (5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 18.75 μL，總體系50 μL。陰性對照不加基因組DNA，以ddH2O補(bǔ)齊到50 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火1 min (不同引物退火溫度見表1)，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增樣品9 μL，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DL-2000 DNA marker判斷擴(kuò)增結(jié)果，對檢測陽性結(jié)果樣品冷凍保存，以備以后分析使用。

2 結(jié) 果

采用改良三色法[10]，對收集到的所有糞便樣本進(jìn)行檢測，可見蟲體呈現(xiàn)明亮粉色，通?？梢姾笠号菀约版咦拥闹行膶浅霈F(xiàn)粉色條紋[10](見圖1),共有9例鏡檢發(fā)現(xiàn)微孢子蟲陽性。

利用糞便基因組提取試劑盒[QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (50)]進(jìn)行全基因組提取，提到的部分基因組以及PCR檢測結(jié)果如圖2。

本研究共調(diào)查124名腹瀉患者 (四川92人、重慶32人)，其中男性66人，女性58人。對所得的124份基因組樣本進(jìn)行6對不同引物的PCR檢測，其中EBIEF1-F/EBIEF1-R這對引物的總檢出率7.26% (9/124)，兒童的檢出率為8.00% (6/75),老年人的檢出率為8.57% (3/35)；EI set 3F/EI set 3R這對引物總檢出率為3.23% (4/124),兒童的檢出率為4.00% (3/75)，老年人的檢出率為2.86% (1/35)；而引物Culi S/A未檢測出陽性 (見表2、表3)。

3 討 論

作為一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的病原微生物，微孢子蟲廣泛流行于世界各地，而目前尚無針對微孢子蟲的特異性藥物，阿苯達(dá)唑、氟馬西尼等雖有一定效用，但其副作用亦不容忽視[3]，所以對微孢子蟲進(jìn)行更深入的研究是很有必要的。

本研究結(jié)果顯示，畢氏腸道微孢子蟲 (E.bieneusi)的檢出率最高 (7.26%，見表2)，腸炎微孢子蟲 (E.intestinalis)的檢出率次之 (3.23%，見表2)，據(jù)現(xiàn)有使用EBIEF1-F/EBIEF1-R這對引物檢測畢氏腸道微孢子蟲的相關(guān)報(bào)道來看，豬的糞便中畢氏腸道微孢子蟲的檢出率高達(dá)30.5%[11]，牛的檢出率為17.5%[12]，山羊的檢出率為28.8%，綿羊更是高達(dá)42.8%[13]。相較其他宿主，如鳥類和野生動物，豬、牛、羊等家畜較為常見，與人類的接觸更為密切，分布范圍也更廣，人畜交叉感染的幾率也相應(yīng)增加，如通過被污染的水等途徑傳播[14]。有理由認(rèn)為畢氏腸道微孢子蟲所對應(yīng)的宿主，地域分布更廣，與人類接觸機(jī)會較大，亦或者環(huán)境適應(yīng)性更好，生存能力更強(qiáng)，所以檢出率更大。對于E.cuniculi保守區(qū)域的引物沒有擴(kuò)增出特異性條帶這一情況，我們認(rèn)為這是因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)所用的糞便樣本并無感染兔腦炎微孢子蟲的情況，故而并未擴(kuò)增出特異性條帶。相較畢氏腸道微孢子蟲和腸炎微孢子蟲而言，人感染兔腦炎微孢子蟲的情況確實(shí)更為少見，所以Culi S/A這對引物未擴(kuò)增出特異性條帶也屬于正常情況[15]。

重慶地區(qū)的樣本來自某兒童?？漆t(yī)院，而四川地區(qū)的樣本來自一家綜合型醫(yī)院，故樣本不同年齡組的人數(shù)分布存在差異。對于不同年齡組的檢出率，兒童組和老年組的檢出率較高，而14～55歲的青壯年檢出率為0 (見表3),或是由于兒童和老年人的免疫力較青壯年弱，更容易被感染。

由于本次實(shí)驗(yàn)的糞便樣本主要來自城區(qū)，考慮到微孢子蟲人畜交叉感染的特性，我們猜測傳染源主要是家養(yǎng)寵物，如貓、犬等的糞便處理不當(dāng)而污染家庭用水以及食物，但若要確認(rèn)是否為上述原因有待進(jìn)一步調(diào)查研究。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，畜牧業(yè)行業(yè)也日漸發(fā)展壯大，微孢子蟲對其的影響越來越深。感染它的動物會在短時(shí)間內(nèi)傳染整個(gè)養(yǎng)殖場內(nèi)的動物，致使大部分經(jīng)濟(jì)類動物長期腹瀉,給養(yǎng)殖場帶來無可挽回的經(jīng)濟(jì)損失。并且人和動物會交叉感染，對于養(yǎng)寵物的人來說，這是個(gè)潛在的安全隱患。并且近年來我國的HIV感染人數(shù)急劇增加，而AIDS患者的腹瀉有30%～50%都與畢氏腸道微孢子蟲有關(guān)，無論是在經(jīng)濟(jì)效益還是人類自身安全方面，此類病原微生物的致病作用都應(yīng)當(dāng)引起我們足夠的重視。

圖1從腹瀉糞便樣本中分離到的多株微孢子蟲 (箭頭所示為微孢子蟲孢子；×1 000)圖2基因組與PCR產(chǎn)物部分電泳結(jié)果 ( A.糞便基因組；B.使用引物EI set 3F/3R得到的PCR產(chǎn)物 (E.intestinalis)；C.使用引物EBIEF1-F/R得到的PCR產(chǎn)物 (E.bieneusi);DNA marker.DL-2000)

Fig.1Microsporidia separated from diarrheal stool specimens.The arrows indicated spores of microsporidia (×1 000)Fig.2Some electrophoretic patterns of genome and PCR products (A.DNA extraction;B.PCR product acquired by using primers EBIEF1-F/R (E.intestinalis);C.PCR product acquired by using primers EI set 3F/3R (E.bieneusi)；DNA Marker.DL-2000)

表2 不同引物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

表3 畢氏腸道微孢子蟲和腸炎微孢子蟲的檢出率分析

注：G1.年齡＜14歲，G2.年齡14～55歲，G3.年齡>55歲

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InvestigationoftheprevalenceofEnterocytozoonbieneusi,EncephalitozoonintestinalisandEncephalitozooncuniculiamongdiarrhealpatientsinthesouthwestofChina

QIU Lu-yao1,2,PING Jing1,2,LI Wen-dao1,2,DING Song-tao1,LIU Han-deng1

(1.CenterofBasicMedicalExperiment,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China;2.CollegeofPediatrics,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China)

ObjectiveTo investigate the prevalence ofEnterocytozoonbieneusi,EncephalitozoonintestinalisandEncephalitozooncuniculiamong diarrheal patients in the southwest of China.MethodsA total of 124 fecal specimens from patients with diarrhea syndrome were collected.The specimens were stained by modified trichrome (weber) and were examined under microscopy.The extracted DNA samples were evaluated by PCR amplification.ResultsThe prevalence ofE.bieneusiwas 7.26% (9/124),and that ofE.intestinaliswas 3.23% (4/124),withE.cuniculiall negative.ConclusionThe infection of microsporidia did exist in the southwest of China,and the most common types in this area wereE.bieneusiandE.intestinalis.

microsporidia;diarrheal patients;infection;zoonotic;PCR amplification

[Chin J Mycol，2017，12(5):257-261]

R 519.8

A

1673-3827(2017)12-0257-05

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (KJ1600202);重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科研與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 (201619)

邱璐瑤，女 (漢族)，本科在讀.E-mail:AprilQiu@stu.cqmu.edu.cn

劉含登,E-mail:hdliu@cqmu.edu.cn

2017-05-24

[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮