謝靜 葛瑛 邱志峰 張凱宇 劉正印 李太生

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院感染內(nèi)科，北京 100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 臨床免疫中心，北京 100730)

·論著·

人類免疫缺陷病毒陰性隱球菌性腦膜炎患者外周血淋巴細胞亞群分析

謝靜1,2葛瑛1邱志峰1張凱宇1劉正印1,2李太生1,2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院感染內(nèi)科，北京 100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 臨床免疫中心，北京 100730)

目的分析人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus,HIV)陰性隱球菌性腦膜炎 (Cryptococcal meningitis，CM)患者外周血淋巴細胞亞群改變特點，深化對隱球菌病發(fā)病機制的認識。方法篩選HIV陰性CM患者31例和健康獻血員21例進行淋巴細胞亞群分析，CM患者根據(jù)是否存在免疫抑制基礎(chǔ)疾病分為兩個亞組，比較3組研究對象淋巴細胞亞群中B、NK、CD4+T、CD8+T細胞亞群，CD4+T及CD8+T細胞的第二信號受體CD28表達比例及CD8+T細胞激活標(biāo)記物HLA-DR、CD38的表達水平。結(jié)果有基礎(chǔ)病CM組B、NK、CD4+T和CD8+T 4種亞群中位數(shù)依次為56×106/L、86×106/L、218×106/L、164×106/L，顯著低于健康對照組的223×106/L、280×106/L、695×106/L、521×106/L (P值均＜0.001)，同時存在CD8+T細胞激活亞群比例較健康對照顯著升高。無基礎(chǔ)病CM患者上述4種細胞亞群中位數(shù)依次為128×106/L、128×106/L、567×106/L、527×106/L，除CD8+T細胞計數(shù)水平與健康對照相似以外，B (P=0.02)、NK (P=0.002)和CD4+T細胞 (P=0.03)計數(shù)均低于健康對照，其CD8+T細胞激活亞群比例與健康對照組相似。CD4+T和CD8+T細胞的CD28表達水平在3組間未見顯著差異。結(jié)論HIV陰性CM患者，無論是否存在免疫抑制基礎(chǔ)疾病，外周血B、NK及CD4+T 3種細胞計數(shù)可出現(xiàn)同時減少。

腦膜炎，隱球菌性；淋巴細胞亞群；CD4+T細胞

隱球菌性腦膜炎 (Cryptococcal meningitis，CM)是由新生隱球菌復(fù)合體 (Cryptococcusneoformans/C.gattiispecies complex)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的侵襲性真菌感染，起病隱匿，臨床誤診率高，如不早期積極針對性治療，可引起顱神經(jīng)不可逆損害，甚至死亡。CM是發(fā)展中國家人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus,HIV)感染者最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)機會性感染[1]，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的廣泛應(yīng)用使HIV相關(guān)性CM發(fā)病率呈現(xiàn)降低趨勢[2]。隨著免疫抑制劑在器官移植、自身免疫病、腫瘤等疾病治療中的應(yīng)用，發(fā)生于HIV陰性但存在免疫功能抑制人群的CM逐漸增多[3]。更為值得注意的是，近年無器官移植、自身免疫病等明確免疫抑制基礎(chǔ)疾病的CM病例也時有報道[4-5]。因此，HIV陰性CM的發(fā)病機制和診療策略引起研究者們重視。

CM的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與患者免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)。但目前關(guān)于HIV陰性CM的研究多集中于流行病學(xué)與臨床特征分析[5-8],對免疫功能的評估僅有少數(shù)報道[9-10]。以往曾將臨床未見明確免疫抑制基礎(chǔ)疾病的CM患者稱為近似免疫正?；颊?(apparently immunocompetent patients)[11]，但已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)這部分患者存在固有免疫的甘露糖結(jié)合凝集素的基因遺傳缺陷[12]，因此“近似免疫正常患者”的免疫是否正常需要更多研究來提供證據(jù)。通過流式細胞術(shù)分析淋巴細胞表型能夠定量檢測各個細胞亞群，為評估機體免疫功能狀態(tài)提供重要信息。本研究對HIV陰性CM患者淋巴細胞亞群進行分析，首先比較了B、NK、CD4+T和CD8+T 4種細胞的比例及計數(shù)，然后分析了T細胞第二信號受體CD28的表達比例、以及CD8+T細胞激活亞群比例的改變，旨在深化對發(fā)病機制的認識，為臨床診治提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2000年1月～2015年12月在我院診治的HIV陰性CM且進行過淋巴細胞亞群檢測的患者。根據(jù)是否存在免疫抑制狀態(tài)及免疫缺陷基礎(chǔ)疾病分為兩個亞組：存在基礎(chǔ)病組和無基礎(chǔ)病組。免疫抑制基礎(chǔ)病包括腫瘤化療后、自身免疫病接受激素或免疫抑制劑治療、糖尿病、肝硬化、慢性腎病透析、及其他疾病需要接受免疫抑制劑治療。CM診斷基于如下腦脊液檢查：墨汁染色鏡檢陽性，隱球菌培養(yǎng)陽性或莢膜多糖抗原滴度>1∶8。健康對照為自我院健康醫(yī)學(xué)部招募的健康獻血員。研究方案通過我院倫理委員會審批。

1.2 外周血淋巴細胞亞群檢測

所檢測亞群包括：B細胞 (CD3-CD19+)、NK細胞(CD3-CD16/56+)、CD4+T細胞(CD3+CD4+)、CD8+T細胞(CD3+CD8+T)、CD4+T和CD8+T細胞的第二信號受體CD28表達比例(CD28+CD4+T/CD4+T，CD28+CD8+T/CD8+T)、CD8+T細胞的HLA-DR、CD38表達比例(HLA-DR+CD8+T/CD8+T，CD38+CD8+T/CD8+T)。對CM患者淋巴細胞亞群的檢測均在抗真菌治療前進行。所用熒光抗體及同型對照均購自美國Becton Dickinson公司。用乙二胺四乙酸三鉀抗凝真空采血管采集外周靜脈血。取流式檢測管，向其中加入熒光抗體組合，再加入100 μL抗凝全血，混勻后室溫避光孵育15 min，加入500 μL溶血素，室溫溶血15 min。加入2 mL磷酸緩沖液，1 500 r/min，5 min，洗滌2次。加入500 μL固定液重懸細胞，經(jīng)FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀 (美國Becton Dickinson公司)上機測定，獲取淋巴細胞亞群比例，再根據(jù)同期外周血常規(guī)檢測淋巴細胞絕對計數(shù)計算得出淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計分析。變量以M(P25,P75)表示。采用非參數(shù)統(tǒng)計檢驗，首先采用Kruskal-WallisH檢驗進行3組獨立樣本比較，存在顯著差異的變量再采用Mann-WhitneyU檢驗進行兩兩組間比較，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象一般資料

CM患者共31例。其中有基礎(chǔ)疾病組16例，男女各8例，年齡 (40±16)歲，包括自身免疫性疾病7例、糖尿病3例、慢性乙型肝炎/肝硬化3例，天皰瘡、尿崩癥及淋巴結(jié)結(jié)核各1例。無基礎(chǔ)病組15例，男10例，女5例，年齡 (42±17)歲。健康獻血員21例，男14例，女7例，年齡 (44±7)歲。3組研究對象在年齡、性別構(gòu)成比方面均未見顯著差異。

2.2 白細胞和淋巴細胞

如表1所示，白細胞計數(shù)在有基礎(chǔ)病CM患者組最低，中位數(shù)為4 145×106/L，顯著低于無基礎(chǔ)病組的7 340×106/L (P=0.02)，與健康對照的5 850×106/L相比存在降低趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，無基礎(chǔ)病組的白細胞計數(shù)水平與健康對照相似。淋巴細胞計數(shù)在有基礎(chǔ)病組最低，其中位數(shù)僅為552×106/L，顯著低于健康對照 (1 949×106/L，P＜0.001)和無基礎(chǔ)病CM組 (1 487×106/L，P＜0.001)，后兩組的淋巴細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.08)。

表1健康對照、有免疫抑制基礎(chǔ)病CM和無免疫抑制基礎(chǔ)病CM 3組外周血淋巴細胞亞群比例及計數(shù)[M(P25,P75)]

Tab.1Peripheral lymphocyte subsets in healthy donors and cryptococcal meningitis patients with or without immunocompromised comorbidities[M(P25,P75)]

健康獻血員(21例)有免疫抑制基礎(chǔ)病CM患者(16例)Pa值無免疫抑制基礎(chǔ)病CM患者(15例)Pb值Pc值WBC(×106/L)5850(5570，6850)4145(2273，7453)0．067340(4800，9260)0．250．02淋巴細胞比例(%)30．1(28．2，36．2)14．0(8．2，23．8)<0．00122．7(14．8，26．8)0．0020．08計數(shù)(×106/L)1949(1674，2185)552(389，907)<0．0011487(1046，2269)0．08<0．001B細胞比例(%)10．5(9．1，13．9)7．0(3．6，15．0)0．1710．9(7．0，13．9)0．660．25計數(shù)(×106/L)223(165，272)56(18，87)<0．001128(107，271)0．02<0．001NK細胞比例(%)14．8(11．1，18．0)15．7(6．0，25．7)0．6110．9(4．9，15．6)0．130．57計數(shù)(×106/L)280(208，340)86(20，158)<0．001128(89，221)0．0020．11CD4+T細胞比例(%)34．7(33．0，40．9)36．8(22．1，47．6)0．8135．3(27．1，40．5)0．640．98計數(shù)(×106/L)695(575，820)218(122，315)<0．001567(380，600)0．03<0．001CD8+T細胞比例(%)24．0(22．0，30．5)30．7(19．5，38．9)0．4333．7(21．9，39．7)0．050．46計數(shù)(×106/L)521(384，585)164(110，258)<0．001527(406，685)0．78<0．001CD28+CD4+T/CD4+T(%)91．3(87．1，95．0)87．0(67．7，94．8)0．1792．3(83．9，97．3)0．800．35CD28+CD8+T/CD8+T(%)51．6(41．6，59．8)35．8(29．2，52．1)0．0547．8(38．4，69．2)0．830．12HLA?DR+CD8+T/CD8+T(%)21．1(11．3，25．5)47．2(15．1，60．7)0．00820．9(7．6，47．4)0．680．16CD38+CD8+T/CD8+T(%)30．4(23．1，38．1)68．5(55．1，79．5)<0．00141．5(18．5，68．9)0．280．04

注：Pa.存在免疫抑制基礎(chǔ)病的CM患者和健康對照比較；Pb.無免疫抑制基礎(chǔ)病的CM患者和健康對照比較；Pc.CM患者兩組間比較

2.3 B、NK、CD4+T和CD8+T細胞亞群

如表1和圖1A所示，淋巴細胞中B、NK、CD4+T和CD8+T 4種細胞亞群所占比例在3組間均未見顯著差異。絕對計數(shù)方面，有基礎(chǔ)病CM組B、NK、CD4+T和CD8+T 4種亞群中位數(shù)依次為56×106/L、86×106/L、218×106/L、164×106/L，顯著低于健康對照組的223×106/L、280×106/L、695×106/L、521×106/L (P值均＜0.001)。無基礎(chǔ)病CM患者上述4種細胞亞群中位數(shù)依次為128×106/L、128×106/L、567×106/L、527×106/L，除CD8+T細胞計數(shù)水平與健康對照相似以外，B (P=0.02)、NK (P=0.002)和CD4+T細胞 (P=0.03)計數(shù)均低于健康對照。CM兩個亞組之間比較，除NK細胞外 (P=0.11)，有基礎(chǔ)病組B、CD4+T和CD8+T細胞計數(shù)均顯著低于無基礎(chǔ)病組 (P值均＜0.001)。從CD4+T細胞計數(shù)構(gòu)成比分布來看 (見圖1B)，有基礎(chǔ)病組16例患者的CD4+T細胞計數(shù)全部低于500×106/L，CD4+T細胞計數(shù)從低到高的患者例數(shù)分布依次為：＜100×106/L 3例、(100～200)×106/L 4例，(200～500)×106/L 9例。無基礎(chǔ)病組CD4+T細胞計數(shù)：＜100×106/L 1例，(200～400)×106/L 5例，>500×106/L 9例 (占60%)。

2.4 CD4+T和CD8+T細胞第二信號受體CD28表達比例

如表1和圖2A所示，有基礎(chǔ)病CM組CD4+T和CD8+T細胞的CD28表達比例中位數(shù)分別為87.0%和35.8%，該比例在無基礎(chǔ)病CM組分別為92.3%和47.8%，在健康對照為91.3%和51.6%。CD4+T和CD8+T細胞的CD28表達水平在3組間未見顯著差異。

2.5 CD8+T細胞激活標(biāo)記物HLA-DR和CD38表達比例

如表1和圖2B所示，CD8+T細胞的HLA-DR表達比例差異僅見于有基礎(chǔ)病CM組和健康對照兩組 (中位數(shù)47.2% vs 21.1%，P=0.008)，無基礎(chǔ)病CM組和健康對照 (P=0.68)以及兩個CM組之間 (P=0.16)均未見顯著差異。CD8+T細胞的CD38表達比例中位數(shù)在有基礎(chǔ)病CM組為68.5%，顯著高于無基礎(chǔ)病CM組的41.5% (P=0.04)和健康對照的30.4% (P＜0.001)。

圖1外周血B、NK、CD4+T、CD8+T細胞亞群絕對計數(shù) (A)和不同CD4+T細胞計數(shù)例數(shù)構(gòu)成比 (B)在健康對照、有免疫抑制基礎(chǔ)病CM和有基礎(chǔ)病CM 3組的比較圖2CD4+T、CD8+T細胞第二信號受體CD28表達比例 (A)和CD8+T細胞激活亞群比例 (B)在健康對照、有免疫抑制基礎(chǔ)病CM和有基礎(chǔ)病CM 3組的比較

Fig.1Peripheral B,NK,CD4+T and CD8+T cells counts (A),proportions of patients with different CD4+T cell count levels (B) in healthy donors and cryptococcal meningitis patients with or without immunocompromised comorbiditiesFig.2CD28expression on CD4+T and CD8+T cells (A),activation markers (HLA-DR and CD38) on CD8+T cells (B) in healthy donors and cryptococcal meningitis patients with or without immunocompromised comorbidities

3 討 論

本研究提示，存在免疫抑制基礎(chǔ)疾病的CM患者外周血淋巴細胞亞群改變以B、NK、CD4+T和CD8+T細胞4種亞群計數(shù)同時顯著降低為主要特點，伴有CD8+T細胞激活水平明顯升高。雖然部分CM患者臨床上未發(fā)現(xiàn)其存在明確免疫抑制基礎(chǔ)疾病，但外周血B、NK及CD4+T 3種細胞同時降低，而CD8+T細胞計數(shù)水平與健康對照類似，而且其激活標(biāo)記物HLA-DR、CD38的表達比例也無顯著改變。

細胞免疫應(yīng)答是機體控制隱球菌感染的主要免疫效應(yīng)機制，因此隱球菌病最常見于T細胞功能抑制/缺陷人群。外周血CD4+T細胞計數(shù)是目前臨床最常用的細胞免疫功能評價指標(biāo)。HIV相關(guān)性CM主要發(fā)生于CD4+T細胞計數(shù)低于100×106/L的患者[13]，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后CD4+T細胞計數(shù)增加到200×106/L以上并持續(xù)6個月可停止抗真菌藥的維持治療[14]。而本研究中兩組HIV陰性CM患者CD4+T細胞計數(shù)雖然均顯著低于健康對照組，但構(gòu)成比各有特點。有基礎(chǔ)病組16例CM患者雖然CD4+T細胞計數(shù)全部低于500×106/L，但其中56%高于200×106/L。而無基礎(chǔ)病組有60%的患者CD4+T細胞計數(shù)高于500×106/L?？傮w來看，與HIV相關(guān)性CM相比，HIV陰性CM患者CD4+T細胞計數(shù)相對較高，尤其是不存在免疫抑制基礎(chǔ)疾病的患者中有相當(dāng)比例CD4+T細胞計數(shù)高于500×106/L，而這一CD4+T細胞計數(shù)水平在HIV感染者通常被認為是不容易發(fā)生機會性感染的人群。造成HIV陽性和陰性人群CM患者CD4+T細胞計數(shù)水平差異的原因目前未知。一個可能的原因推測與細胞功能有關(guān)，細胞數(shù)量不低但其功能缺陷也會導(dǎo)致免疫應(yīng)答缺陷無法有效控制感染。本研究中CD4+T和CD8+T細胞的CD28表達水平在3組研究對象間未見顯著差異。CD28是T細胞第二信號受體，CD28陰性的T細胞無法被活化、呈無能 (anergy)狀態(tài)，CD28可被認為是反應(yīng)T細胞功能的指標(biāo)之一。因此，從細胞因子產(chǎn)生、增殖能力等方面探討CM患者細胞免疫功能是將來值得深入研究的方向。

免疫激活是免疫系統(tǒng)啟動免疫防御機制的正常過程,HLA-DR和CD38是目前應(yīng)用較多的兩種激活標(biāo)記物。HLA-DR是主要組織相容抗原復(fù)合體 (MHC)Ⅱ類分子，表達于細胞表面參與活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗原肽提成[15]。CD38屬于Ⅱ型單鏈類跨膜糖蛋白，參與淋巴細胞的活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化和增殖的調(diào)節(jié)等，淋巴細胞前體高表達CD38，隨著細胞分化成熟CD38表達降低，當(dāng)出現(xiàn)抗原刺激時，活化的淋巴細胞重新高表達CD38[16]。本研究中雖然基礎(chǔ)病CM組CD8+T細胞激活水平明顯升高，但不能除外其基礎(chǔ)病本身引起淋巴細胞亞群改變[17-18]，尤其是結(jié)合無基礎(chǔ)病CM組CD8+T細胞的HLA-DR、CD38表達比例與健康對照相比無顯著變化，更加合理的推測是：中樞神經(jīng)系統(tǒng)的隱球菌感染可能不會對外周血CD8+T細胞的HLA-DR、CD38表達造成影響，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的激活指標(biāo)進行直接檢測會提供更加有力的證據(jù)[10]。

B和NK細胞分別是體液免疫和固有免疫的效應(yīng)細胞。B和NK細胞計數(shù)降低是本組CM患者淋巴細胞亞群改變的另一特點。這與國外研究結(jié)果不同。美國的研究顯示，與健康對照相比，無免疫抑制基礎(chǔ)病的CM患者外周血B和NK細胞計數(shù)無顯著改變[10]。上述差異的原因目前未知，值得未來做進一步研究。

本研究為觀察性研究，不同研究對象的淋巴細胞亞群改變特點與疾病之間的關(guān)系只能得出存在相關(guān)性的結(jié)論，無法推論出因果關(guān)系。存在基礎(chǔ)疾病的CM患者，需要綜合考慮基礎(chǔ)病本身和免疫抑制劑等治療手段對淋巴細胞亞群造成的影響，因此這一組病例淋巴細胞亞群的改變是多種因素共同作用的結(jié)果。無基礎(chǔ)疾病的CM患者，不能除外存在罕見免疫缺陷病的情況[13]，囿于臨床診療手段的局限性，目前無法逐一排除。本研究對患者淋巴細胞亞群的檢測均在抗真菌治療前進行，未能觀察治療前后的淋巴細胞亞群變化?；诒敬螜M斷面研究的結(jié)果，CM患者抗真菌治療前后多個時間點淋巴細胞亞群變化的縱向隊列研究是未來值得探討的內(nèi)容。

本研究對HIV陰性CM患者淋巴細胞亞群的分析表明，無論是否存在免疫抑制基礎(chǔ)疾病，外周血B、NK及CD4+T 3種細胞計數(shù)可表現(xiàn)出同時減少。這一結(jié)果提示，CM患者淋巴細胞亞群的動態(tài)改變及其與抗真菌治療療效的相關(guān)性是未來值得深入研究的方向。近年流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國隱球菌病患者中不存在器官移植、自身免疫病等明確免疫抑制基礎(chǔ)疾病的比例可高達60%以上，這一比例明顯高于歐洲和北美等地區(qū)[13,19]，未來需要重視對這部分患者CM的發(fā)病機制、治療及預(yù)后研究。

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ImmunophenotypeofperipherallymphocytesinHIV-negativepatientswithcryptococcalmeningitis

XIE Jing1,2,GE Ying1,QIU Zhi-feng1,ZHANG Kai-yu1,LIU Zheng-yin1,2,LI Tai-sheng1,2

(1.DepartmentofInfectiousDiseases,PekingUnionMedicalCollegeHospital,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China;2.ClinicalImmunologyCenter,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China)

ObjectiveTo find if immunophenotypic features of peripheral lymphocytes was associated with risk of cryptococcal meningitis (CM) in HIV-negative individuals.MethodsA total of 31 CM patients treated at a tertiary hospital in Beijing,China were included.They were divided into immunocompromised comorbidity group (n=16) and apparently immunocompetent group (n=15).Twenty-one healthy donors were included as control group.Lymphocyte subsets including B,NK,CD4+T,and CD8+T cells,CD28expression on T cells,and activation markers (HLA-DR and CD38) on CD8+T cells were determined by flow cytometry and compared among the three groups.ResultsCompared with healthy donors,immunocompromised comorbidity group had dramatically decreased median B cell (223 vs.56/μL),NK cell (280 vs.86/μL),CD4+T cell (695 vs.218/μL),and CD8+T cell (521 vs.164/μL) counts (Pvalues for all four subsets＜0.001).Proportions of activated CD8+T cells were significantly increased in immunocompromised patients than that in healthy control.Except for CD8+T cell counts (527/μL),the median B cell (128/μL,P=0.02),NK cell (128/μL,P=0.002) and CD4+T cell (567/μL,P=0.03) were moderately reduced in the apparently immunocompetent group than those in the healthy donors.The levels of HLA-DR and CD38on CD8+T cells in the apparently immunocompetent group were similar with the healthy donors.CD28expression on CD4+T and CD8+T cells did not differ among the three groups.ConclusionsThe immunophenotype of CM patients with im-munocompromised comorbidity was characterized by generalized decreased B,NK,CD4+T,and CD8+T cells.Mild-to-moderate reduce in B cell,NK cell and CD4+T cell counts were observed in apparently immunocompetent patients.

cryptococcal meningitis;lymphocyte subsets;CD4+T cell

[Chin J Mycol，2017，12(5):262-267]

R 519.4

A

1673-3827(2017)12-0262-06

國家科技支撐計劃課題 (2014BAI07B06)，北京協(xié)和醫(yī)院中青年科研基金 (pumch-2016-2.3)

謝靜，女 (漢族)，博士，助理研究員.E-mail:xiejing@pumch.cn

葛瑛,E-mail:geyingpumch@126.com

2017-03-24

[本文編輯] 施 慧