楊婧 ，張宏偉 ，葛權(quán)虎 ，趙伯文 ，彭心宇 ，張示杰 ，孫紅 ，吳向未 ，郭淑霞 *

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，新疆 石河子 832002）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在肝包蟲(chóng)外囊壁鈣化中的作用

楊婧1，張宏偉1，葛權(quán)虎1，趙伯文1，彭心宇1，張示杰1，孫紅1，吳向未1，郭淑霞2*

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，新疆 石河子 832002）

為探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)在囊型包蟲(chóng)外囊壁鈣化中所起的作用。采用分離肝包蟲(chóng)囊腫囊壁細(xì)胞并誘導(dǎo)其向成骨分化的方法，同時(shí)成骨培養(yǎng)基中添加不同濃度的重組人源BMP-2（rh BMP-2）和抑制劑并誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化，茜素紅染色評(píng)估囊壁細(xì)胞成骨分化能力；通過(guò)觀察囊腫情況和對(duì)囊壁組織行免疫組化，評(píng)估BMP-2因子對(duì)囊壁鈣化的影響。結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)后，囊壁細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)增多，外源性的rh BMP-2可促進(jìn)囊壁細(xì)胞礦化，而抑制劑卻抑制了這種效果。在肝包蟲(chóng)的動(dòng)物模型中，抑制劑抑制囊壁細(xì)胞的鈣化，使得囊腫變小、蟲(chóng)體活力減低。由此可知，包蟲(chóng)囊腫囊壁細(xì)胞具有成骨分化潛能，體外成骨誘導(dǎo)可獲得成骨細(xì)胞樣表型；BMP-2促進(jìn)包蟲(chóng)囊腫囊壁細(xì)胞鈣化；藥理學(xué)調(diào)控作用下的囊壁鈣化將成為包蟲(chóng)病新的治療靶點(diǎn)。

包蟲(chóng)外囊壁；鈣化；BMP-2

包蟲(chóng)病是由細(xì)粒棘球蚴絳蟲(chóng)引起人畜共患寄生蟲(chóng)病，肝臟是最常受累的器官[1]，肝包蟲(chóng)病主要流行于我國(guó)西北及西南等地。臨床中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)包蟲(chóng)囊腫外囊壁會(huì)發(fā)生鈣化，且常伴有囊腫內(nèi)容物的退化以及囊腫尺寸的縮減，生物學(xué)上稱之為“非活躍期”，臨床稱之為“靜止性病變”，當(dāng)囊壁鈣化情況加重，蟲(chóng)體則大量死亡，這是因?yàn)槟冶诖蠓秶拟}化使得蟲(chóng)體從周圍組織攝取營(yíng)養(yǎng)變的更難[2-3]。因此，從藥理學(xué)方面調(diào)控囊壁的鈣化可能成為這類疾病新的治療靶點(diǎn)，但是目前外囊壁鈣化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，目前尚不明確。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)是一種由細(xì)胞分泌的、具有異位成骨能力的生長(zhǎng)因子，因其能夠參與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，目前被廣泛運(yùn)用于骨折愈合、生物工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-5]。先前，已有學(xué)者提出在包蟲(chóng)外囊壁組織表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）[3]，那么作為TGF-β超家族成員，BMP是否參與了包蟲(chóng)外囊壁的鈣化過(guò)程，是否對(duì)于包蟲(chóng)囊壁的鈣化起到影響作用？本研究我們將通過(guò)外囊壁細(xì)胞培養(yǎng)以及建立肝包蟲(chóng)動(dòng)物模型來(lái)探討B(tài)MP-2在囊壁鈣化中發(fā)揮的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：2個(gè)月大的免疫缺陷C57BL/6小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(新)2011-0003，在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)，其飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)為SYxK(新)2011-0001)。包蟲(chóng)病羊肝：購(gòu)置于昌吉屠宰場(chǎng)。

實(shí)驗(yàn)試劑：α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)置于美國(guó)Gibco公司，青霉素、硫酸鏈霉素、10%胎牛血清（FBS）購(gòu)置美國(guó)Hyclone公司，重組人源BMP-2購(gòu)置美國(guó)RD公司，地塞米松、β-甘油磷酸、抗壞血酸-2-磷酸、SB203580、茜素紅均購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 肝包蟲(chóng)囊腫的囊壁細(xì)胞（HPCs）

獲得CE患者知情同意后，在病人行肝包蟲(chóng)外囊摘除術(shù)的同時(shí)收集囊壁組織，并通過(guò)膠原酶消化法分離培養(yǎng)囊壁細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含青霉素（100 U/mL），硫酸鏈霉素（100 μg/mL）以及 10%FBS，細(xì)胞放于 37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，去除沒(méi)有貼壁的細(xì)胞，并用PBS輕柔的洗滌2次，換上新鮮的培養(yǎng)液。以后每2 d換一次液，約生長(zhǎng)至80%～90%底面積后按1∶2比例傳代。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和人皮膚成纖維細(xì)胞（DFBs）由曹旭教授（美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)整形外科）提供。

1.2.2 HPCs體外成骨分化實(shí)驗(yàn)

HPCs接種在含10%FBS、地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸、5 μmol/L抗壞血酸 -2-磷酸的α-MEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞接種密度為5×103/cm2，以含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。細(xì)胞誘導(dǎo)分化21 d后，茜素紅染色。

1.2.3 肝臟包蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/h4>

通過(guò)無(wú)菌方法從感染細(xì)粒棘球蚴病羊肝的囊泡中獲取包蟲(chóng)囊液，通過(guò)蟲(chóng)體移動(dòng)度以及HE染色后光鏡下觀察鑒定蟲(chóng)體活性。鹽酸氯胺酮（50 mg/kg）麻醉小鼠，行中線開(kāi)腹手術(shù)，肝被膜下種植0.2 mL濃度相同的原頭蚴沉積物。

1.2.4 B MP-2干預(yù)

待建模2月后，使用30 mg/kg的重組BMP-2因子腹腔注射，連續(xù)注射7周后，觀察囊腫鈣化情況。

1.2.5 免疫組化

小鼠安樂(lè)死后，中線剖腹行肝切除，10% 的甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片（厚為4 μm），茜素紅染色，光鏡下觀察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以X±S表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方法分析（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離出的HPCs獲得了成骨樣細(xì)胞表型

HPCs、BMSCs和DFBs成骨分化能力的鑒定。3種細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d茜素紅染色。結(jié)果表明：在BMSC組和HPCs組，成骨樣礦化結(jié)節(jié)均較對(duì)照組顯著增加，這兩組礦化結(jié)節(jié)的表達(dá)水平幾乎相當(dāng)，然而DFBs組礦化結(jié)節(jié)的表達(dá)水平卻非常低（圖1）。

圖1 肝包蟲(chóng)病囊外腫囊壁細(xì)胞成骨潛能Fig.1 Osteogenic potential of cells within pericysts of CE

2.2 BMP-2促進(jìn)細(xì)胞礦化

為了評(píng)估BMP-2對(duì)于HPCs成骨分化能力，HPCs 培 養(yǎng) 在 添 加 有 不 同 濃 度（0、100、200、400 ng/mL）BMP-2 以及不同濃度（10、20、30、40 μmol/L）BMP-2抑制劑SB203580的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，結(jié)果表明：BMP-2促進(jìn)了成骨樣礦化結(jié)節(jié)的形成，濃度越高礦化結(jié)節(jié)越明顯，然而SB203580抑制了礦化結(jié)節(jié)的形成，濃度越高礦化結(jié)節(jié)越稀少，且二者的變化均成濃度依賴性（圖2）。

圖2 體外BMP-2蛋白對(duì)囊壁細(xì)胞礦化的影響Fig.2 Effect of modulating BMP-2 signaling on mineralization of HPCs in vitro

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，使用BMP-2促進(jìn)囊壁的鈣化

為了解體內(nèi)BMP-2對(duì)包蟲(chóng)囊腫生長(zhǎng)的影響，通過(guò)腸系膜靜脈，將原頭節(jié)注射至免疫缺陷小鼠腹腔內(nèi)，在原頭節(jié)注射2個(gè)月后，小鼠腹腔注射相同劑量的BMP-2因子，7周后觀察包蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：對(duì)照組30只小鼠中，有21只小鼠可見(jiàn)稍大的囊泡。對(duì)照組包蟲(chóng)囊腫，體積較大，較明亮，鈣化不明顯（圖3a）；BMP-2組中，有19只小鼠可見(jiàn)稍小的、乳白色的鈣化斑點(diǎn)，未見(jiàn)液性的囊泡。BMP-2組，包蟲(chóng)囊腫體積較小，乳白色，鈣化明顯（圖3b）。

圖3 BMP-2體內(nèi)對(duì)包蟲(chóng)囊腫的作用Fig.3 Effect of BMP-2 on mineralization of the pericyst wall in vivo

囊腫切除后，茜素紅染色，光鏡下觀察。結(jié)果表明：在正常生長(zhǎng)的囊腫外囊壁，可見(jiàn)少量的礦化沉積。光鏡下觀察，對(duì)照組茜素紅染色，提示紅色礦化帶不明顯（圖3c）；BMP-2處理后，可見(jiàn)大量的囊腫囊壁礦化沉積。光鏡下觀察，BMP-2組茜素紅染色，提示紅色礦化帶明顯（圖3d）。以上表明BMP-2可促進(jìn)包蟲(chóng)的囊壁鈣化。

3 討論

目前，盡管存在很多種治療肝包蟲(chóng)病的方法，但外科手術(shù)仍然是首選治療方案，外科手術(shù)有多種術(shù)式可被選擇，這些術(shù)式的基本原則均是根除囊腫以及通過(guò)控制囊腫破潰降低復(fù)發(fā)率[6-8]。對(duì)于那些因?yàn)槟挲g、復(fù)合病變以及囊腫生長(zhǎng)位置不佳等因素而不能行外科手術(shù)的患者，抗包蟲(chóng)藥物的治療也能取得一定的效果[9-10]。當(dāng)前包蟲(chóng)病治療的藥理靶點(diǎn)是抗寄生蟲(chóng)，因?yàn)榧纳x(chóng)妨礙了葡萄糖的吸收，導(dǎo)致患者糖原耗竭以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生一系列退變[11]。過(guò)去的幾十年里，許多化療藥物已成為主要的或者輔助的方案用于抗寄生蟲(chóng)治療[12]，目前運(yùn)用較為廣泛的藥物包括甲苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑[13]。雖然口服這些藥物能夠維持一定的血漿濃度，但囊腫穿刺對(duì)于臨床醫(yī)生來(lái)講仍有一定難度，因此迫切需要尋找新的抗包蟲(chóng)治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，包蟲(chóng)病囊腫囊壁細(xì)胞具有成骨潛能，BMP-2促進(jìn)囊壁細(xì)胞的礦化和成骨成熟。研究發(fā)現(xiàn)BMP-2是參與骨分化的重要調(diào)節(jié)者，鄒學(xué)軍等[14]發(fā)現(xiàn)人重組BMP-2誘導(dǎo)小鼠BMSCs細(xì)胞7 d后，成骨分化明顯。BMP-2活性多肽能有效地促進(jìn)OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化，其誘導(dǎo)作用存在劑量依賴關(guān)系[15]。邵云峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)腺病毒介導(dǎo)的人BMP-2基因轉(zhuǎn)染的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)中可以向成骨細(xì)胞定向分化，并保持較強(qiáng)的增殖能力。研究表明BMP-2可能是通過(guò)與其不同的兩種受體（I型和II型）結(jié)合形成異二聚體，誘導(dǎo)Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，或通過(guò)Smad信號(hào)通路依賴的絲裂原活化蛋白激酶（ERK、JNK、p38MAPKs）發(fā)揮其生物學(xué)作用[17]。孫欣等[18]通過(guò)加入BMP-2及相應(yīng)阻斷劑觀察BMP-2和p38絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)在BMSC向成骨細(xì)胞分化中的作用，發(fā)現(xiàn)BMP-2組BMSC中ALP活性和鈣沉積量增加，阻斷劑組表達(dá)明顯延遲，提示BMP-2可通過(guò)p38MAPK通路促進(jìn)BMSC向成骨細(xì)胞分化。以上研究均提示BMP-2在骨分化過(guò)程中扮演著重要角色。我們的研究發(fā)現(xiàn)肝包蟲(chóng)囊腫囊壁細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后具有成骨細(xì)胞樣表型，提示囊壁細(xì)胞具有成骨潛能，并且在體內(nèi)外，BMP-2促進(jìn)囊壁細(xì)胞成骨分化。

大多數(shù)寄生囊腫囊壁會(huì)有鈣化，且常伴有囊腫內(nèi)容物和囊腫大小的退行性變，寄生蟲(chóng)壓迫改變了其周圍組織血管的生長(zhǎng)環(huán)境；同時(shí)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化和外膜鈣化引起的壞死灶有關(guān)，外膜鈣化使得蟲(chóng)體攝取營(yíng)養(yǎng)變得更加困難，甚至還可能導(dǎo)致蟲(chóng)體死亡，這也加劇了這一情況[2-3]。本研究最重要的發(fā)現(xiàn)是BMP-2促進(jìn)包蟲(chóng)囊壁的鈣化，而囊壁的鈣化直接關(guān)系到囊腫的發(fā)展?fàn)顟B(tài)以及蟲(chóng)體的活性。我們重點(diǎn)觀察了BMP-2對(duì)囊腫生長(zhǎng)的局部療效，盡管BMP-2對(duì)全身反應(yīng)的影響目前尚無(wú)定論，但對(duì)于包蟲(chóng)病病人而言，BMP-2確實(shí)是一個(gè)比較有吸引力的治療靶點(diǎn)，給這類患者抗包蟲(chóng)治療帶來(lái)了新的希望。

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Effect of bone morphogenetic protein BMP-2 on the calcification of hydatid cysts

Yang Jing1，Zhang Hongwei1，Ge Quanhu1，Zhao Bowen1，Peng Xinyu1，Zhang Shijie1，Sun Hong1，
Wu Xiangwei1，Guo Shuxia2*
(1 The First Affiliated Hospital of the Medical College,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Department of Preventive Medicine,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

Objective to evaluate the effect of modulating BMP-2 signaling on the calcification of hydatid pericyst.Methods Pericyst cells were isolated from hepatic hydatid cysts.These cells were cultured with osteogenic media and were evaluated for mineralization capacity using Alizarin Red staining.Cells were also treated with different doses of recombinant human BMP-2 and BMP-2 inhibitor,and the mineralization capacity were analyzed using Alizarin Red staining.The effects of inhibiting BMP-2 signaling on calcification ofpericystwallswere evaluated through insightinto hydatid cyststhemselvesand immunohistochemical analysis.Results Cells within the pericyst showed high levels of mineralized nodule formation,as induced by osteogenic media.These effect could be intensified by adding recombinant human BMP-2 (rh BMP-2)and inhibited by BMP-2 inhibitor. In the animal model of cystic echinococcosis,inhibition of BMP-2 signaling decreased calcification of the pericyst wall,which was associated with decreased cysts and lower viability of protoscoleces.Conclusion Cells within the pericysts acquire an osteoblast-like phenotype and have osteogenic potential.BMP-2 increases hydatid cyst calcification.Pharmacological mediation of calcification in pericysts may lead to new strategies for therapeutic intervention of hydatid disease.

Hydatid pericyst；Calcification；BMP-2

R562

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.008

1007-7383(2017)05-0570-04

2017-03-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81360453，81260412）

楊婧（1987-）,女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)獒t(yī)院管理。

*通信作者：郭淑霞（1962-），女，教授，從事流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)研究，e-mail：pge888@sina.com。