詹光熙，彭書敏，美麗古麗·莫合買提，郭曉青*

（1石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子，832003；2同濟大學附屬第一婦嬰保健院，上海 200040）

人卵巢癌裸鼠卵巢原位移植瘤模型的構(gòu)建

詹光熙1，彭書敏1，美麗古麗·莫合買提1，郭曉青2*

（1石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子，832003；2同濟大學附屬第一婦嬰保健院，上海 200040）

為探討人卵巢癌進展機制的相關(guān)研究，構(gòu)建適宜的體內(nèi)動物模型。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定過表達綠色熒光報告基因(GFP)的人EOC細胞模型：SKOV3(人卵巢漿液性腺癌細胞株)和ES-2(人卵巢透明細胞癌細胞株)；異氟烷吸入麻醉4-6周齡BALB/C(nu/nu)雌性裸鼠，從裸鼠背部正中縱切口進入腹腔，顯微多點注射法分別將細胞模型懸液，移植于裸鼠的單側(cè)卵巢，每組6只裸鼠；NightOWL活體成像系統(tǒng)動態(tài)觀察裸鼠移植瘤生長和轉(zhuǎn)移情況；移植術(shù)后4-6周解剖裸鼠，取卵巢和轉(zhuǎn)移瘤組織行HE染色。結(jié)果顯示，攜帶GFP的EOC細胞模型SKOV3和ES-2，均可成功構(gòu)建裸鼠卵巢原位移植瘤模型，裸鼠未發(fā)生手術(shù)原因死亡，成功率均100%；活體成像系統(tǒng)通過檢測GFP的熒光強度和范圍，能夠動態(tài)監(jiān)測裸鼠移植瘤生長情況；SKOV3細胞模型構(gòu)建的卵巢癌和轉(zhuǎn)移瘤組織，HE染色觀察病理特征符合人卵巢漿液性腺癌；ES-2細胞模型構(gòu)建的卵巢癌和轉(zhuǎn)移瘤組織，HE染色觀察病理特征符合人卵巢透明細胞癌。由此可知，異氟烷吸入麻醉、從背部正中縱切口進入腹腔、顯微多點注射法移植攜帶GFP的EOC細胞模型，能成功構(gòu)建可動態(tài)監(jiān)測的裸鼠卵巢原位移植瘤動物模型；該動物模型與人卵巢癌生物學特征類似，適宜作為研究人卵巢癌演變進展的體內(nèi)模型。

卵巢癌；裸鼠；卵巢原位移植瘤模型；顯微多點注射法

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤[1]，早期往往缺乏典型臨床癥狀，且沒有靈敏的標志物和篩選手段，約超過70%的病人在被確診時已是疾病晚期，其5年生存率不到30%，極易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學特性是導(dǎo)致其預(yù)后差、死亡率高的主要因素之一[2]。故深入研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制尤為重要。Fu等[3]在1993年首次建立了卵巢原位移植瘤裸鼠模型，相比體外細胞模型，該動物模型與人卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移等生物學行為方面更為接近，故在研究卵巢癌相關(guān)研究中受到了廣泛關(guān)注。雖然近年關(guān)于該動物模型的構(gòu)建方法不斷更新，但仍存在一定的缺陷。

因此，為探索更好的研究卵巢癌的進展演變的動物模型，本實驗構(gòu)建了攜帶綠色熒光報告基因(GFP)的人卵巢漿液性腺癌細胞株SKOV3和人卵巢透明細胞癌細胞株ES-2；顯微多點注射法構(gòu)建裸鼠卵巢原位移植瘤模型；借助NightOWL活體成像系統(tǒng)動態(tài)觀察裸鼠移植瘤的生長和演變；證實該動物模型能較好的模擬人卵巢癌生物學特征，適宜作為研究人卵巢癌演變進展的體內(nèi)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢漿液性腺癌細胞株SKOV3和人卵巢透明細胞癌細胞株ES-2均來自上海市第一婦嬰保健院中心實驗室。10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RPMI培養(yǎng)基、PBS及胰酶均購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。GFP慢病毒購自上海和元生物技術(shù))有限公司(合同編號：HYFW-lenti-610074HD，病毒滴度：2.55×108)。氣體麻醉劑異氟烷購自河北九塔制藥有限公司。

BALB/C(nu/nu)裸鼠，雌性，鼠齡4-6周齡，體重14~16 g，SPF(無特定病原體)級，購于同濟大學實驗動物中心，總共12只。恒溫(25±2)℃，恒濕45%~50%，飼養(yǎng)于同濟大學實驗動物中心的凈化空氣層流架中。

手術(shù)用顯微注射器購自瑞士哈美頓(Hamilton)(貨號：80386)10 μL，32 G。顯微持針鑷(MY-R120201)，眼瞼拉鉤(YZB020)，精細手術(shù)剪(JA2603)，圓柄無損傷鑷子(MY-140202)，眼科鑷(JD1040)，精細彈簧剪(MY-S121002)，Dumont#5 鑷 子 (508-1001)，Dumont#7鑷子(703-0702)，以上器材均購自上海牧巖商貿(mào)有限公司。7-0外科縫合線購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司，活體成像系統(tǒng) (NightOWLⅡLB 983)，影像分析軟件(indigo)。

1.2 方法

1.2.1 攜帶GFP基因細胞系的構(gòu)建

人卵巢癌細胞株SKOV3和ES-2細胞用含1%雙抗、10%FBS RPMI1640培養(yǎng)液在 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待融合度為30%~40%時將帶有GFP基因的慢病毒進行轉(zhuǎn)染，病毒加藥量(μL)=(細胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度)/103。并添加濃度為5ug/mL的感染增強劑Polybrene，病毒感染8 h后觀察細胞狀態(tài)并更換新的全培。轉(zhuǎn)染72 h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察報告基因——綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)表達，以監(jiān)測感染效率。取相同方法對人卵巢癌細胞株進行二次感染。

1.2.2 雌性裸鼠卵巢原位移植瘤的建立

攜帶GFP基因的SKOV3和ES-2細胞分別對6只雌性裸鼠進行卵巢原位移植。常規(guī)消化對數(shù)生長期的細胞模型，計數(shù)活細胞數(shù)量，并調(diào)整細胞濃度使每10 μL含1×106個細胞懸液置冰上待用。

異氟烷持續(xù)吸入麻醉4-6周齡無胸腺雌性裸鼠，俯臥位，固定四肢，消毒背部皮膚鋪無菌洞巾，在裸鼠背部正中縱行剪開長約1 cm皮膚，向左側(cè)牽拉皮膚，暴露左側(cè)腹膜，顯微無損傷鑷輕輕提起腹膜后剪開進入腹腔，于左腎下極脂肪墊處找到卵巢子宮，顯微無損傷鑷小心牽拉出子宮卵巢于腹膜外，顯微無損傷鑷固定卵巢位置，顯微注射器于卵巢處多點注射構(gòu)建的EOC細胞模型懸液共5 μL，將卵巢囊還納于腹腔，7-0可吸收線縫合關(guān)閉腹膜腔，取7-0可吸收縫線間斷縫合皮膚，再次消毒皮膚，烤燈照射恢復(fù)裸鼠體溫，復(fù)蘇裸鼠，手術(shù)結(jié)束。將裸鼠送回SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，密切觀察術(shù)后裸鼠的生長情況。

1.2.3 裸鼠卵巢原位移植瘤模型動態(tài)觀察

裸鼠卵巢原位移植術(shù)后1周每日觀察裸鼠一般狀況、腹部張力及體重變化，進食、大小便、膚色、體重、生活規(guī)律等情況，1周后隔日觀察。原位移植術(shù)后第2-4周，以每周一次的頻率通過活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠卵巢原位移植瘤形成情況；在術(shù)后第5-6周，以每3 d一次的頻率通過活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠卵巢原位移植瘤形成情況。

1.2.4 病理學檢查

建模后依據(jù)裸鼠的一般情況，約4-6周后處死裸鼠；全面解剖裸鼠盆腹腔臟器及雙肺組織，記錄腹水量及性狀；觀察腫瘤形成、形態(tài)、浸潤及轉(zhuǎn)移情況，測量腫瘤體積及重量；無菌條件下留取裸鼠卵巢腫瘤組織，PBS沖洗，取部分組織-80℃凍存?zhèn)溆?，另一部分置于中性甲醛液中固定、石蠟切片、HE染色鏡下觀察其細胞形態(tài)、組織學分型、細胞分級等。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建攜帶GFP基因的EOC細胞模型

倒置熒光顯微鏡下觀察第1次慢病毒感染后的細胞，24 h可見少量綠色熒光，72h可見綠色熒光最多最亮，感染率約為80%。(圖1a)第2次慢病毒感染后72小時，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞綠色熒光感染率約為95%。(圖1b)

圖1 慢病毒兩次感染SKOV3和ES-2細胞的感染效率(×200)Fig.1 The infection efficiency of SKOV3 and ES-2 cells infected by lentivirus twice

2.2 雌性裸鼠卵巢原位移植瘤術(shù)后的活體成像觀察

顯微多點注射法完成裸鼠原位移植瘤手術(shù) (圖2)12/12只裸鼠在卵巢原位移植后第2周通過活體成像系統(tǒng)下可見腫瘤GFP蛋白的熒光，隨著腫瘤的生長，熒光強度逐漸增強，面積逐漸增大。通過活體成像系統(tǒng)觀察，兩株腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的不同時期分別出現(xiàn)了不同程度的腹腔轉(zhuǎn)移(圖3)。

圖 2 顯微多點注射法構(gòu)建裸鼠卵巢原位移植瘤模型手術(shù)經(jīng)過Fig.2 Construction of nude mice orthotopic transplanted tumor model by micro multipoint injection

圖 3活體成像系統(tǒng)動態(tài)觀察不同時期兩株卵巢癌細胞原位移植瘤模型腫瘤的發(fā)展情況Fig.3 In vivo imaging system dynamic observed the development in different stages of two ovarian cancer orthotopic xenograft tumor models

2.3 原位移植瘤組織學檢查

解剖卵巢原位移植瘤術(shù)后第4-6周裸鼠，可見移植瘤大體外觀：左側(cè)卵巢已形成巨大瘤塊，外觀不規(guī)則，質(zhì)硬，切面見大小不等的灰白色融合性團塊。肉眼大體觀察可見在SKOV3和ES-2細胞卵巢原位移植瘤裸鼠體內(nèi)均出現(xiàn)了遠處的腸系膜轉(zhuǎn)移。將兩株卵巢癌細胞原位移植瘤模型的卵巢原位腫瘤和腸系膜轉(zhuǎn)移瘤行HE染色，顯微鏡觀察可見正常的卵巢上皮細胞已經(jīng)被腫瘤細胞替代，成片塊狀彌漫分布或排列成團狀，細胞核大且深染，細胞分化程度低。SKOV3細胞模型構(gòu)建的卵巢和轉(zhuǎn)移瘤組織，HE染色觀察病理特征符合人卵巢漿液性腺癌 (圖4a)；ES-2細胞模型構(gòu)建的卵巢和轉(zhuǎn)移瘤組織，HE染色觀察病理特征符合人卵巢透明細胞癌(圖4b)。

圖4 原位移植瘤模型的解剖大體觀和組織HE染色(×400)Fig.4 Anatomical general observation and tissue HE staining of orthotopic transplanted tumor model

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，起病隱匿、侵襲轉(zhuǎn)移率高，是導(dǎo)致其死亡率極高的主要原因。因此，深入研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制，從而改善其不良預(yù)后是目前臨床亟待解決的難題。在卵巢癌組織學類型中，漿液性卵巢癌是最常見的組織學類型，其次是透明細胞卵巢癌，它們分別占上皮性卵巢癌的68%和12%[4]。雖然透明細胞癌在上皮性卵巢癌的總發(fā)生率并不高，但與其他組織類型的卵巢癌相比，透明性卵巢癌因具有先天的化療耐藥性，往往在接受手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，不僅惡性程度更高，且化療敏感性更低，即便接受聯(lián)合鉑類化療藥物的綜合治療，其預(yù)后一般也都較差[5]。本研究選取常用的人卵巢漿液性腺癌細胞株SKOV3和人卵巢透明細胞癌細胞株ES-2作為研究對象，具有較高的臨床代表性；并且SKOV3和ES-2細胞的體外培養(yǎng)較為容易、對數(shù)生長周期較短，生物學特性穩(wěn)定。

目前裸鼠卵巢癌移植瘤模型通常分為3種：皮下移植瘤模型，腹腔移植瘤模型，以及卵巢原位移植瘤模型[6]。皮下移植瘤模型能直觀的觀察腫瘤的形成情況，可用來檢測腫瘤的增殖能力，但并不能模擬卵巢癌在腹腔內(nèi)極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的臨床特征。腹腔移植瘤模型較皮下移植瘤模型更接近卵巢癌的體內(nèi)生長環(huán)境，且腫瘤在腹腔的播散以及腹水的形成均與臨床上卵巢癌的臨床癥狀相似，然而腹腔移植瘤模型并不能模擬卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的初始階段，并不能模擬在此階段激素微環(huán)境對腫瘤播散的影響。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與基因突變相關(guān)，且與腫瘤細胞所在微環(huán)境相關(guān)。腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境、細胞外基質(zhì)以及腫瘤血管形成等諸多條件的協(xié)同進化(co-evolution)，促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。研究表明，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與雌激素水平相關(guān)[8-10]，且卵泡刺激素能誘導(dǎo)卵巢癌發(fā)生上皮間質(zhì)化(EMT)進而促進卵巢癌的遠處播散轉(zhuǎn)移[11]。因此在模擬卵巢癌腫瘤微環(huán)境和生物學行為等方面，卵巢原位移植瘤模型能夠比另外兩種模型更客觀真實地反映卵巢癌生物學特性。

目前，GFP基因已被廣泛應(yīng)用于腫瘤成像模型[12-14]。本實驗將攜帶GFP基因的卵巢癌細胞移植入雌性裸鼠卵巢內(nèi)，借助體外活體成像系統(tǒng)的生物熒光成像法(BFI)，利用熒光蛋白在外源光源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號，可動態(tài)監(jiān)測腫瘤在體內(nèi)的形成、生長以及轉(zhuǎn)移情況。相較于熒光素酶報告基因法，該方法無需對實驗裸鼠進行熒光底物注射，能減少對實驗動物的損傷，同時GFP的熒光信號強度更高[15]。此外，相比于間斷解剖以期連續(xù)觀察腫瘤生長轉(zhuǎn)移情況，本研究可在同一只裸鼠上達到與之相同的效果，能節(jié)省動物使用量、實驗周期和經(jīng)費。

目前，卵巢原位移植瘤模型構(gòu)建方法主要有細胞懸液卵巢原位注射法和瘤塊卵巢原位移植法[16-18]。后者方法操作過程較為復(fù)雜，對手術(shù)技能及手術(shù)器械的精度要求較高。且相較兩種方法，前者其既能減少皮下移植成瘤所需的裸鼠數(shù)量，也能減少相應(yīng)的建模時間。本研究也對細胞懸液卵巢原位注射法進行了改進，即通過顯微注射法對卵巢由單點注射改為多點注射，該方法既可減少單點注射形成的囊泡導(dǎo)致的壓力性溢出，亦可減少實驗原因?qū)е碌姆N植播散。通過術(shù)后觀察未發(fā)現(xiàn)貫穿、針道漏液等情況。同時實驗中對手術(shù)部位的腹膜進行縫合關(guān)閉，能更大限度的減少誤差并避免了人為種植播散等狀況的發(fā)生。

本研究通過上述實驗證實，采用異氟烷吸入麻醉雌性裸鼠、從裸鼠背部正中縱切口進入腹腔、顯微多點注射法移植攜帶GFP的EOC細胞模型，能成功構(gòu)建裸鼠卵巢原位移植瘤動物模型。該動物模型與人卵巢癌的生物學特征類似、能持續(xù)動態(tài)觀察卵巢癌在裸鼠體內(nèi)演變進展、節(jié)省裸鼠用量、縮短研究時間及科研成本，適宜作為研究卵巢癌的體內(nèi)模型。該模型的構(gòu)建，為進一步探索卵巢癌演變進展提供了較為客觀可信的模型。

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Orthotopic construction of human ovarian carcinoma xenograft model in nude mice

Zhan Guangxi1,Peng Shumin1,Meiliguli Mohemaiti1,Guo Xiaoqing2*
(1 School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 First Maternity and Infant Hospital Affiliated to Tongji University,Shanghai 200040,China)

To build a suitable animal ovarian cancer model in vivo,so as to study the mechanism of its progression.Lentivirus transfection technology was used to build a green fluorescent protein (GFP)marked EOC cells model:SKOV3 (human ovarian serous carcinoma cell lines)and ES-2 (human ovarian clear cell carcinoma cell lines).After isoflurane anesthesia,4-6 week old BALB/C(nu/nu)nude female,back into the abdominal cavity from the median longitudinal incision.Micro multipoint injection method was used to transplant suspension cell model in one side ovary;Night OWL vivo imaging system was used to dynamically observe the growth and metastasis of xenografts in nude mice.Nude mice were dissected at 4-6 weeks after transplantation,the ovarian and metastatic tissues were stained with HE.Both SKOV3 and ES-2 GFP positive cell model was successfully constructed with ovarian orthotopic xenograft.nude mice did not lead to surgical death,the success rate of orthotopic transplanted tumor model in nude mice was 100%.The in vivo imaging system can dynamically monitor the growth of a transplanted tumor in nude mice by detecting the fluorescence intensity and range of GFP.SKOV3 cell model was built-in ovarian canceer and metastatic tissues,HE staining pathological features consistent with human ovarian serous adenocarcinoma;ES-2 cell model was built-in ovarian cancer and metastatic tissues,HE staining pathological features consistent with human ovarian clear cell carcinoma.it can be concluded that inhalation of isoflurane anesthesia,middle of the back vertical incision into the abdominal cavity,micro multipoint injection of GFP-carrying EOC cell model,can be successfully constructed dynamic observation of ovarian orthotopic transplantation tumor in nude mice animal models.This animal model is similar to the biological characteristics of human ovarian cancer and is suitable as an in vivo model to study the development of human ovarian cancer.

ovarian cancer；nude mice；ovarian orthotopic transplanted tumor model；micro multipoint injection method

R711.75

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.009

1007-7383(2017)05-0574-06

2017-01-15

國家自然科學基金項目(81372305)

詹光熙(1990-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向為婦產(chǎn)科學。

*通信作者：郭曉青(1966-)，女，教授，從事婦科腫瘤研究，e-mail：Xiaoqing_Guo@163.com。