張安，常聰，孟霞，范娟，張文學

(四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065)

紅曲固態(tài)發(fā)酵產Monacolin K工藝條件的優(yōu)化

張安，常聰，孟霞，范娟，張文學*

(四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065)

采用響應面優(yōu)化法對紅曲產Monacolin K的固態(tài)發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，結果表明：最佳發(fā)酵條件為氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培養(yǎng)溫度28 ℃、裝米量31.77 g/250 mL三角瓶、初始含水量40.72%、接種量11.14% (V/V)，該設計中模型預測的Monacolin K最大值為0.256%，進行重復驗證實驗，得到Monacolin K實測值為0.258%，與模型預測值接近。此結果可為大規(guī)模生產功能性紅曲提供一定的理論基礎。

紅曲；Monacolin K；固態(tài)發(fā)酵條件；響應面法

紅曲是以大米為基質，接種紅曲霉發(fā)酵而得的一種深紅色物質[1]。紅曲可以用于釀酒、制醋，也可作為糕點等食品的著色劑和調味劑，還可作為中藥使用[2]。研究表明[3]：紅曲的次級代謝產物Monacolin K可強有力地抑制膽固醇的合成，是安全、高效、低毒的降血脂物質，其市場需求量很大[4,5]。但是Monacolin K卻因其產量較低、紅曲產品質量不穩(wěn)定等缺點，不適合于工業(yè)化大規(guī)模生產，因此通過發(fā)酵條件優(yōu)化，提高紅曲的Monacolin K產量，是當前解決功能紅曲問題的重要途徑[6]。熊曉輝等[7]確定了大米培養(yǎng)基中添加附加碳源、氮源、無機鹽的種類以及添加量。劉愛英等[8]研究稱，選取碳水化合物及蛋白質含量高、碳氮比較低的大米進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，其產物的Monacolin K含量較高。Chiu等[9]將紅曲霉接種于旋轉式帶有5 cm孔徑發(fā)酵床設備中，固態(tài)發(fā)酵生產紅曲米，達到了節(jié)約成本、縮短發(fā)酵時間、簡化發(fā)酵工藝的目的。本文首先進行一系列的單因素實驗，確定紅曲固態(tài)發(fā)酵各影響因素的大致范圍，接著采用Plackett-Burman設計法篩選出顯著性較高的主要影響因子，最后通過Box-Behnken實驗設計進行非線性擬合，得到擬合方程并繪制出響應圖，得出紅曲固態(tài)發(fā)酵的最佳條件，以期進一步提高其發(fā)酵產Monacolin K水平，從而為車間工業(yè)化生產紅曲提供前期理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

紫色紅曲霉QH24(Monascuspurpureus)，本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，無水葡萄糖2%，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：清洗后的大米浸泡1 h，瀝干水分，蒸煮至米粒分散、微粘、無白心狀態(tài)。蒸煮后的大米分別取30 g分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

色譜純：甲醇、磷酸；分析純：甲醇、無水葡萄糖、瓊脂粉、冰乙酸、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏；市售：大豆粉、玉米粉。

1.1.4 主要儀器設備

單人雙面凈化工作臺、立式壓力蒸汽滅菌鍋、臺式高速冷凍離心機、高效液相色譜儀、電熱恒溫真空干燥箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、電子天平、pH計、超聲清洗機、可調萬用電爐、電磁爐、蒸鍋、40目篩等。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲米制作方法

種子液：將紅曲霉斜面孢子刮下置于三角瓶中，振蕩充分，無菌脫脂棉過濾孢子液，將孢子稀釋至濃度約為 106～107個/mL，以2%的接種量接種于培養(yǎng)基中，120 r/min，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。

紅曲米：將種子液按照10%(V/V)接種量接種于裝有30 g大米基礎培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，并用無菌玻璃棒打散，于28 ℃培養(yǎng)15天。

1.2.2 紅曲中Monacolin K的檢測方法[10，11]

將紅曲發(fā)酵產物于40 ℃下烘干研磨至40目，稱取0.5 g于50 mL容量瓶中，加入適量無水甲醇，室溫下超聲1 h，中間間歇振蕩3～4次最終定容到50 mL。以4000 r/min的轉速離心10 min。取上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液取20 μL經HPLC檢測，并根據(jù)HPLC標準曲線計算內酯式及酸式Monacolin K含量，并計算Monacolin K總含量。HPLC檢測方法參考QB/T 2847-2007。

1.2.3 單因素實驗

進行一系列單因素實驗，對附加碳源種類及其添加量、附加氮源種類及其添加量、初始含水量、初始pH、接種量、裝米量、培養(yǎng)溫度7個會對紅曲霉生長狀況產生影響的發(fā)酵條件進行實驗，分析其對紅曲霉菌Monacolin K產率的影響。

1.2.4 Plackett-Burman實驗

用Plackett-Burman法篩選出單因素實驗中對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的影響最為顯著的因素。

1.2.5 Box-Behnken實驗

根據(jù)Plackett-Burman實驗得出的顯著性因素，設計Box-Behnken實驗，并對最終紅曲固態(tài)發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件進行驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 附加碳源種類及添加量對Monacolin K產量的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加5%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘油作為附加碳源，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將不添加任何附加碳源進行固態(tài)發(fā)酵的紅曲米作為空白對照，實驗結果見圖1中a。當以淀粉為單獨的附加碳源時，Monacolin K的產量最高，達到0.225%，選擇影響最大的淀粉作為紅曲固態(tài)發(fā)酵的碳源。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加2%，4%，6%，8%，10%的淀粉為附加碳源，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將不添加任何附加碳源進行固態(tài)發(fā)酵的紅曲米作為空白對照，實驗結果見圖1中b。當?shù)矸厶砑恿繛?%時，Monacolin K含量最高，達到0.227%。選擇4%作為碳源添加量。

圖1 不同附加碳源及添加量對Monacolin K產量的影響Fig.1 Effects of different types and different dosage of additional carbon source on the yield of Monacolin K

2.1.2 附加氮源種類及添加量對Monacolin K產量的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加2%的玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、大豆粉作為附加氮源，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將不添加任何附加氮源進行固態(tài)發(fā)酵的紅曲米作為空白對照，實驗結果見圖2中a。當以玉米粉為單獨的附加氮源時，Monacolin K的產量最高，達到0.215%。選擇玉米粉作為紅曲固態(tài)發(fā)酵的氮源。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加1%，2%，3%，4%，5%的玉米粉為附加氮源，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將不添加任何附加氮源進行固態(tài)發(fā)酵的紅曲米作為空白對照，實驗結果見圖2中b。當玉米粉添加量為1%時，Monacolin K含量最高，達到0.218%。選擇1%作為氮源添加量。

圖2 不同附加氮源及添加量對Monacolin K產量的影響Fig.2 Effects of different types and different dosage of additional nitrogen source on the yield of Monacolin K

2.1.3 不同接種量對Monacolin K產量的影響

接種量分別為6%，8%，10%，12%，14%(V/V)，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將不接種紅曲霉菌的大米培養(yǎng)基作為空白對照，實驗結果見圖3。當接種量為10%(V/V)時，Monacolin K含量最高，達到0.196%。選擇10%(V/V)作為紅曲固態(tài)發(fā)酵的接種量。

圖3 不同接種量對Monacolin K產量的影響Fig.3 Effects of different inoculum size on the yield of Monacolin K

2.1.4 不同初始含水量對Monacolin K產量的影響

按照40 ℃下烘干法測定固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水量，控制固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水量分別為20%，30%，40%，50%，60%，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將生米滅菌接種紅曲霉進行固態(tài)發(fā)酵作為空白對照，實驗結果見圖4。當初始含水量為40%時，Monacolin K含量最高，可達到0.199%。選擇40%作為紅曲固態(tài)發(fā)酵的初始含水量。

圖4 不同初始含水量對Monacolin K產量的影響Fig.4 Effects of different initial water content on the yield of Monacolin K

2.1.5 不同初始pH對Monacolin K產量的影響

用乙酸溶液調節(jié)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基使其初始pH值分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將自然pH的大米培養(yǎng)基(pH值7.2)接種進行固態(tài)發(fā)酵作為空白對照，實驗結果見圖5。當初始pH為5.0時，Monacolin K含量最高，達到0.228%。選擇5.0作為紅曲固態(tài)發(fā)酵的初始pH。

圖5 不同初始pH對Monacolin K產量的影響Fig.5 Effects of different initial pH values on the yield of Monacolin K

2.1.6 不同培養(yǎng)溫度對Monacolin K產量的影響

分別以26，28，30，32，34 ℃作為紅曲固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并將室溫條件(16 ℃左右)下固態(tài)發(fā)酵的紅曲米作為空白對照，實驗結果見圖6。當培養(yǎng)溫度為28 ℃時，Monacolin K含量最高，達到0.198%。選擇28 ℃作為三角瓶紅曲固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度。

圖6 不同培養(yǎng)溫度對Monacolin K產量的影響Fig.6 Effects of different cultivation temperatures on the yield of Monacolin K

2.1.7 不同裝米量對Monacolin K產量的影響

分別添加10，20，30，40，50 g的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中，進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，實驗結果見圖7。當三角瓶中的裝米量為30 g/250 mL時，Monacolin K含量最高，達到0.196%。選擇30 g/250 mL作為紅曲固態(tài)發(fā)酵的裝米量。

圖7 不同裝米量對Monacolin K產量的影響Fig.7 Effects of different amount of rice on the yield of Monacolin K

綜上所述，紅曲固態(tài)發(fā)酵產Monacolin K的最佳單因素條件為：氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培養(yǎng)溫度 28 ℃、裝米量30 g/250 mL三角瓶、初始含水量40%、接種量10%(V/V)。

2.2 Plackett-Burman實驗結果

2.2.1 Plackett-Burman實驗設計

以上述7個因素作為實驗因子，再設計4個空項方便誤差分析，選擇適宜的高低水平，使用Design-Expert分析軟件進行PB實驗設計，以Monacolin K總產量作為響應值，進行實驗分析。Plackett-Burman實驗的因素水平設計見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素水平設計表Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels design table

2.2.2 Plackett-Burman實驗結果與討論

按照2.2.1設計的實驗進行紅曲固態(tài)發(fā)酵，并提取發(fā)酵產物中的Monacolin K，HPLC法進行測定，將測定結果填入表2。采用Design-Expert軟件對Monacolin K產量進行數(shù)據(jù)回歸分析，結果見表3。

表2 Plackett-Burman實驗設計與結果Table 2 Plackett-Burman experimental design and results

其中模型Prob>F=0.0044，相關系數(shù) R2=0.9759，可知該回歸模型極顯著(P<0.01)，其擬合程度及可信度很高，該設計較成功。

表3 Plackett-Burman實驗結果分析Table 3 Plackett-Burman experimental results analysis

由表3可知，因素 X6(裝米量)、X3(接種量)、X4(初始含水量)對Monacolin K產量的影響達到了顯著水平(P<0.05)。

2.3 響應面設計實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計

采用Design-Expert 軟件，對初始含水量、接種量、裝米量3個因素進行實驗設計，Box-Behnken實驗設計因素與水平表見表4。

表4 Box-Behnken實驗因素水平設計表Table 4 Box-Behnken experimental factors and levels design table

2.3.2 響應面設計實驗結果與分析

按照2.3.1的實驗設計進行紅曲固態(tài)發(fā)酵實驗，將各實驗組測定的Monacolin K產量填入表5。

表5 Box-Behnken實驗設計與結果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

運用Design-Expert分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合處理，得到二次回歸分析的一系列相關數(shù)據(jù)，見表6，得出目標值Y對A(裝米量)、B(初始含水量)和C(接種量)3個顯著性因素的二次多項式回歸方程：

Y=+0.25+0.033A+0.014B+0.024C+0.017AB+0.031AC+0.011BC-0.061A2-0.077B2-0.081C2。

式中：Y 為Monacolin K產值(%)，A，B，C為考察因素的編碼值。

表6 Box-Behnken實驗結果分析Table 6 Box-Behnken experimental results analysis

對QH24紅曲霉Monacolin K總產量的回歸模型進行方差分析，回歸模型極顯著(P<0.0001)?；貧w模型的相關系數(shù)R2=0.9819，校正系數(shù)RAdj2=0.9586，說明該回歸模型誤差較小，且與實際實驗結果擬合性很好，可以對紅曲固態(tài)發(fā)酵條件進行分析及預測。通過顯著性分析可知：回歸模型的一次項均顯著(P<0.05)，二次項均極顯著(P<0.0001)，而交互項AC顯著(P<0.05)，AB，BC不顯著(P>0.05)。3個因素對紅曲固態(tài)發(fā)酵產Monacolin K能力的影響強度順序依次為裝米量>接種量>初始含水量。利用Design-Expert做出二次回歸方程的響應面及其等高線，見圖8(a和b)、圖9(a和b)、圖10(a和b)。

圖8 裝米量(A)和初始含水量(B)對Monacolin K產量的影響Fig.8 The effects of amount of rice (A) and initial water content (B) on yield of Monacolin K

注：接種量為10%(V/V)。

由圖8可知，當接種量為10%(V/V)時，裝米量和初始含水量兩個因素的相互影響不顯著(P>0.05)。由圖8中a可知，接種量不變時，隨初始含水量及裝米量的增加，Monacolin K的產量均呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。由圖8中b可知，裝米量在28～35 g范圍內，初始含水量在38%～44%范圍內時，Monacolin K產量較高。

圖9 裝米量(A)和接種量(C)對Monacolin K產量的影響Fig.9 The effects of amount of rice (A) and inoculum size (C) on yield of Monacolin K

注：初始含水量為40%。

由圖9可知，當初始含水量為40%時，裝米量和接種量兩個因素的相互影響顯著(P<0.05)。由圖9中a可知，初始含水量不變時，隨接種量及裝米量的升高，Monacolin K的產量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。由圖9中b可知，裝米量在28～35 g范圍內，接種量在8%～12%范圍內時，Monacolin K產量較高。

圖10 初始含水量(B)和接種量(C)對Monacolin K產量的影響Fig.10 The effects of initial water content (B) and inoculum size (C) on yield of Monacolin K

注：裝米量為30 g。

由圖10可知，當裝米量為30 g時，接種量和初始含水量兩個因素的相互影響不顯著(P>0.05)。由圖10中a可知，Monacolin K產量隨接種量及初始含水量的升高先增加后減少。由圖10中b可知，初始含水量在38%～44%范圍之間，接種量在8%～12%范圍內時，Monacolin K產量較高。

對二次回歸方程求解，編碼值：A=0.033，B=0.014，C=0.024。對其解碼后可得3個因素的真實值，A=31.77，B=40.72，C=11.14，該真實值即為影響紅曲中Monacolin K產量的3個顯著性因素之間的最佳組合：裝米量31.77 g、初始含水量40.72%、接種量11.14%(V/V)，該設計中模型預測的Monacolin K最大產量值為0.256%。

為驗證該模型，采用模型中的最佳發(fā)酵條件：氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培養(yǎng)溫度28 ℃、裝米量31.77 g、初始含水量40.72%、接種量11.14%(V/V)，進行了重復驗證實驗，結果見表7。Monacolin K實測值為0.258%，與模型的預測值接近，說明該模型是準確有效的。

表7 重復實驗Table 7 Repeatability experiment %

3 結論

本文首先進行一系列單因素實驗，得出影響紅曲固態(tài)發(fā)酵產Monacolin K的各因素最佳范圍，接著采用Plackett-Burman實驗篩選出顯著性因素，以Monacolin K產量為響應值，設計Box-Behnken響應面實驗，最終得到紅曲固態(tài)發(fā)酵最佳條件：氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培養(yǎng)溫度 28 ℃、裝米量31.77 g、初始含水量40.72%、接種量11.14%(V/V)，按照以上條件進行重復驗證實驗，Monacolin K實測值為0.258%，與模型的預測值接近，說明該模型是準確有效的。本研究為大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵紅曲的工藝提供了理論基礎。

[1]李東,謝靜,王敏,等.紅曲起源新考[J].中藥材,2007,30(4):484-487.

[2]李東,劉源,謝靜,等.紅曲的起源、分類學及生藥學鑒定[J].中國藥業(yè)藥學專論,2009,18(3):1-2.

[3]Endo A.Monacolin K,a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglu-taryl coenzyme a reductase[J].Antibitics,1980,33(3):334-336.

[4]Ratner S J,楊文凱譯.高血脂癥的治療動向[J].國外醫(yī)藥-合成藥、生化藥、制劑分冊,1996,13(5):259-263.

[5]涂志英,邵偉.國內外紅曲的應用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].中國釀造,2008(7):7-9.

[6]李永麗,雷恒,王紅磊,等.HPLC法測定紅曲誘變菌種中Monacolin K含量[J].食品工程,2010(5):125-128.

[7]熊曉輝,張李陽,韋策,等.紅曲霉菌產Monacolin K固體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].無錫輕工大學學報,2004(1):20-23.

[8]劉愛英,孫偉,梁宗琦,等.不同米質發(fā)酵生產紅曲對莫納可林K含量的影響[J].貴州農業(yè)科學,2003,31(5):5-7.

[9]Chiu C,K Ni,Y Guu,et al.Production of red mold rice using a modified Nagata type koji maker [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73(2):297-304.

[10]朱效剛.紅曲功能性成分分析及發(fā)酵法生產的研究[D].無錫:江南大學，2005.

[11]胡文效,魏彥鋒,蔣錫龍,等.高產Monacolin K紅曲霉菌種的誘變選育及液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2013,34(24):296-301.

OptimizationofSolid-stateFermentationConditionsforMonascusProducingMonacolinK

ZHANG An, CHANG Cong, MENG Xia, FAN Juan, ZHANG Wen-xue*

(College of Light Industry, Textile and Food Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

In order to explore the effects on metabolic capacity of Monacolin K, use the response surface method to optimize the solid-state fermentation conditions forMonascusstrains.The results show that the optimal fermentation conditions are obtained: nitrogen source (corn powder) 1%, carbon source (starch) 4%, initial pH of 5.0, cultivation temperature of 28 ℃, amount of rice of 31.77 g/250 mL triangular flask, initial moisture content of 40.72%, inoculum size of 11.14% (V/V). The maximum model prediction value of Monacolin K in the design is 0.256%, the repeated validation experiments are carried out with the best experimental conditions in the model, and the measured value of Monacolin K is close to the predicted value of 0.258%, which can provide a certain theoretical basis for large-scale production of functionalMonascus.

Monascus；Monacolin K；solid-state fermentation conditions；response surface method

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.008

1000-9973(2017)12-0038-06

2017-06-20 *通訊作者

四川省瀘州市科技計劃(2015CDLZ-S07)

張安(1993-)，女，碩士，研究方向：食品科學；

張文學(1963-)，男，教授，博士生導師，研究方向：發(fā)酵工程。