許艷俊，郝林

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

蘋果醋釀造過程中蘋果酸含量的變化規(guī)律

許艷俊，郝林*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

以新鮮富士蘋果為原料，進(jìn)行蘋果醋的釀造。探究蘋果汁經(jīng)由酒精發(fā)酵以及醋酸發(fā)酵后成為蘋果醋的各個過程中蘋果酸含量的變化規(guī)律。以紫外分光光度計法測定蘋果酸的含量，結(jié)果表明：在確定的酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵條件下，蘋果酸的含量呈逐漸下降的規(guī)律：當(dāng)酵母菌為SH221時由酒精發(fā)酵前的14.975 mg下降為醋酸發(fā)酵后的2.35 mg，下降率為84.31%；而當(dāng)酵母菌為SH222時由酒精發(fā)酵前的14.975 mg下降為醋酸發(fā)酵后的2.06 mg，下降率為86.24%。從而闡述了蘋果醋整個釀造過程中蘋果酸含量變化的規(guī)律。

蘋果醋；蘋果酸；酒精發(fā)酵；醋酸發(fā)酵；紫外分光光度法

蘋果是我國主要的水果產(chǎn)品之一，除鮮食外，主要是加工生產(chǎn)濃縮蘋果汁。蘋果醋是近幾年興起的蘋果加工產(chǎn)品，不僅含有醋的食療保健功效，還富有蘋果的營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味口感[1]。

蘋果醋中的有機酸除乙酸外，還含有蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸等不揮發(fā)酸[2]，這些有機酸決定了蘋果醋的酸味質(zhì)量。尤其是蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸具有緩沖乙酸的刺激性，提高蘋果醋的酸味平和性，使酸味柔和、醇厚。有利于改善醋的酸味質(zhì)量，并賦予其特色的酸味，這對于風(fēng)味較淡的蘋果醋產(chǎn)品質(zhì)量尤為重要[3]。

蘋果酸具有增強消化功能，降低有害膽固醇的水平，增強心臟功能，維持正常的血糖血壓水平，防止癌細(xì)胞的生成，使皮膚增白，保持皮膚的光滑滋潤，消除體內(nèi)重金屬等優(yōu)點。自然界存在的蘋果酸都是L-蘋果酸。L-蘋果酸是一種重要的天然有機酸，1967年，被美國食品和藥品管理局登記確認(rèn)為一種安全、無毒、無害、可食用的有機酸[4]。L-蘋果酸是人體必需的有機酸，也是一種低熱量的理想食品添加劑。本研究旨在闡明蘋果醋釀造過程中蘋果酸含量的變化規(guī)律，為通過改變蘋果酸的含量來改善蘋果醋的口感提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

酵母菌：SH221和SH222，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實驗室保藏菌種；醋酸菌：滬釀1.01，購于中國工業(yè)微生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 YEPD培養(yǎng)基

酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，蒸餾水100 mL，在121 ℃，0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.2.2 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖1 g，酵母膏1 g，無水CaCO32 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，在121 ℃，0.1 MPa條件下滅菌20 min后冷卻至60 ℃，加入3 mL無水乙醇。

1.2.3 種子培養(yǎng)基

葡萄糖1 g，酵母粉1 g，水100 mL，在121 ℃，0.1 MPa條件下滅菌20 min后冷卻至60 ℃，加入3.5 mL無水乙醇[5]。

1.2.4 醋酸菌保藏培養(yǎng)基

酵母膏1 g，葡萄糖1 g，瓊脂2 g，水100 mL，pH 5.5，0.1 MPa滅菌20 min，滅菌后冷卻到70 ℃時加入95%酒精2 mL。

1.3 試劑

新鮮富士蘋果、成品蘋果醋(市售)、15%的TiCl3溶液(分析純)、硫酸98%(不含硝酸鹽，分析純)、2,7-萘二酚溶液(分析純) 上海源葉生物科技有限公司；蘋果酸(分析純)、果膠酶(30000 U/mL) 法國拉曼公司；檸檬酸(食品級)、NaCl(食品級)、蔗糖(食品級)。

1.4 儀器

UV-5100紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；WYT-4手持折光儀 泉州中友光學(xué)儀器有限公司；ZQPW-250全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊波特瑞儀器設(shè)備有限公司；PB-21酸度計、分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市光明醫(yī)療儀器廠；酒精計 河北省武強縣阜陽儀表廠；BJ-CDSERIES超凈工作臺 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；YXQ-LS-50S11高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DF205電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京醫(yī)療設(shè)備工廠。

1.5 檢測方法

可溶性固形物含量檢測：采用折光儀法；還原糖(以葡萄糖計)含量檢測：快速費林法(GB/T 19777-2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》中還原糖的測定)；酒精含量檢測：蒸餾法(GB/T 5009.48-2003《蒸餾酒及配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的分析法中比重計法)；總酸(以醋酸計)含量檢測：氫氧化鈉滴定法(GB/T5009.39-2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》分析法)。

1.6 菌種活化

1.6.1 酵母菌

將斜面保藏的酵母菌按1%的接種量接種至配好的100 mL YEPD培養(yǎng)基上，30 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，備用。

1.6.2 醋酸菌

醋酸菌以5%的質(zhì)量體積比接種在100 mL的種子培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)48～72 h左右，然后稀釋涂布到固體培養(yǎng)基上。選取長勢較好的單菌落取1環(huán)接入100 mL的種子培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)48～72 h左右，得到活化好的醋酸菌種子液[6,7]。

1.7 蘋果醋中蘋果酸含量的測定

1.7.1 定性測定

三氯化鈦法[8]：在試管中加入5 mL的待測果醋，滴入3滴15% TiCl3溶液，在幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)白色沉淀，表明有蘋果酸存在，如果氣溫太低，可將試管在手中溫?zé)幔荒茉跓粞嫔霞訜?，因為煮沸時檸檬酸溶液也有類似反應(yīng)。

1.7.2 定量測定

紫外分光光度法[9]：取1 mL果醋，加入6 mL 98%硫酸，加入0.1 mL 2,7-萘二酚溶液，在100 ℃下水浴加熱20 min，冷卻至接近室溫后，在390 nm紫外光下比色測定，空白水樣同法處理，做儀器調(diào)零之用。

1.7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

稱取0.3 g蘋果酸，倒入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度線，作為儲備液，濃度為6 mg/mL。分別取2，4，6，8，10 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至10 mL，則濃度分別為1.2，2.4，3.6，4.8，6 mg/mL。然后各取1 mL分別加入6 mL 98%的濃硫酸以及0.1 mL的2,7-萘二酚溶液。按照定量測定蘋果酸含量的方法進(jìn)行測定。

1.7.4 蘋果醋釀造工藝流程

新鮮成熟蘋果→挑選→清洗→破碎→浸泡→榨汁→酶解→滅酶→調(diào)整糖度→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵。

1.7.5 步驟

原料處理：選擇無病蟲害、色澤鮮艷、成熟的蘋果，洗凈后切成3～5 mm左右的果丁，放入0.10%檸檬酸和1.0% NaCl混合1 L左右的護(hù)色液中，浸泡10 min，然后置于打漿機中打漿，打漿結(jié)束后測蘋果酸的含量。

在榨好的蘋果汁溶液中加入蘋果漿的0.1%～0.15%的果膠酶，然后在45 ℃下酶解2 h。將酶解結(jié)束后的蘋果汁樣品在80 ℃水浴下滅酶15 min。

成分調(diào)整：根據(jù)2 g/dL糖生成1°(V/V)酒精來補加糖量，試驗初期調(diào)整發(fā)酵液的初始糖度為14%[10,11]。

酒精發(fā)酵：選取酵母菌SH221和SH222分別以接種量8%接入調(diào)整好的發(fā)酵液中，在28 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵7天后，靜置澄清，測定酒精度[12]。

醋酸發(fā)酵：醋酸發(fā)酵初始酒精度為7%，接種量為10%，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵7天左右[13,14]。每隔24 h測定其酸度，待發(fā)酵液酸度不再增加，停止醋酸發(fā)酵。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每個實驗3個平行，實驗結(jié)果用Excel進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 蘋果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of malic acid content

由圖1可知，R2值大于0.999，即線性相關(guān)，說明此標(biāo)準(zhǔn)曲線比較理想。

2.2 蘋果酸含量的變化

圖2 醋酸發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid content in acetic acid fermentation process

由圖2可知，在整個醋酸發(fā)酵過程中總酸的含量依次增加：在酵母菌為SH221時，總酸含量由0.282 g/dL到發(fā)酵結(jié)束后3.612 g/dL；在酵母菌為SH222時，總酸含量由0.318 g/dL到發(fā)酵結(jié)束后3.622 g/dL。

圖3 釀造過程中蘋果酸含量的變化Fig.3 Change of malic acid content in the brewing process

由圖3可知，在整個過程中，蘋果酸的含量呈先增加后下降再下降的趨勢。蘋果汁在酒精發(fā)酵前蘋果酸的含量增加，在酒精發(fā)酵過程中蘋果酸含量逐漸下降：在酵母菌為SH221時，蘋果酸含量由酒精發(fā)酵起始的14.975 mg/mL到發(fā)酵結(jié)束后的2.79 mg/mL；在酵母菌為SH222時，由酒精發(fā)酵起始的14.975 mg/mL到發(fā)酵結(jié)束后的2.219 mg/mL，且在醋酸發(fā)酵過程中，蘋果酸含量小幅度下降：在酵母菌為SH221時，蘋果酸含量由醋酸發(fā)酵起始的2.79 mg/mL到發(fā)酵結(jié)束后的2.35 mg/mL；在酵母菌為SH222時，由酒精發(fā)酵起始的2.219 mg/mL到發(fā)酵結(jié)束后的2.06 mg/mL，整個釀造過程中，不論使用酵母菌SH221或者SH222，蘋果酸的含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

對比圖2和圖3可知，在醋酸發(fā)酵過程中隨著總酸的增加，蘋果酸含量逐漸下降?？偹岷棵黠@高于醋酸發(fā)酵起始及終止的蘋果酸含量，說明蘋果酸的測定具有準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本文以新鮮富士蘋果為原料，進(jìn)行酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，測定各個釀造過程中蘋果酸的含量，得出在整個蘋果醋的釀造過程中蘋果酸含量的變化及其規(guī)律：在酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過程中，蘋果酸含量逐漸下降。說明在蘋果醋的釀造過程中，存在使得蘋果酸含量下降的機制，這為以后探究其機理提供了理論依據(jù)。

陳義倫等研究原汁蘋果醋中的有機酸所得結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上更加具體地闡明了在整個釀造過程中蘋果酸含量的變化規(guī)律，補充了在酒精發(fā)酵前以及蘋果汁中蘋果酸的含量，并測定了在醋酸發(fā)酵過程中總酸(以醋酸計)含量的變化，為蘋果酸的含量變化規(guī)律提供了依據(jù)。

在酒精發(fā)酵前蘋果酸含量顯著高于蘋果汁中含量的機理以及在酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵過程中使蘋果酸含量下降的機制還有待探究及闡明。醋酸菌是否擁有使蘋果酸含量下降的能力等，可以通過后續(xù)細(xì)化以及正交實驗探究其機理。探究蘋果醋釀造過程中蘋果酸含量的變化機制，可以為改善口味、增加蘋果醋營養(yǎng)價值提供理論依據(jù)。

[1]趙敏,竇冰然,駱海燕,等.蘋果醋發(fā)酵工藝及醋飲料的研究[J].食品工業(yè),2016(4):27-29.

[2]劉瑞山,尹海麗,梁治軍.反相高效液相色譜法測定蘋果醋中5種有機酸[J].食品工業(yè),2014(6):254-256.

[3]陳義倫,裘立群,陳偉,等.原汁蘋果醋中的有機酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004(8):92-95.

[4]吳軍林,吳清平,張菊梅.L-蘋果酸的生理功能研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2008(11):692-695.

[5]周幗萍,汪芳安,高冰.醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究[J].中國釀造,2004(6):18-19.

[6]張慶文,張偉,李波,等.臍橙醋半連續(xù)發(fā)酵工藝[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(8):51-55.

[7]原德樹.液態(tài)深層發(fā)酵蘋果醋及蘋果醋飲料的研制[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(5):523-526.

[8]何皓,李霜,付永前,等.TiCl3法快速篩選L-蘋果酸高產(chǎn)突變株[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(28):12080-12081.

[9]吳清平,周小燕,鐘瑜,等.發(fā)酵液中L-蘋果酸批量定量測定研究[J].微生物學(xué)通報,1992(6):366-370.

[10]Cong K,Essy K F,Dan L,et al.Chitosan-based adsorption and freeze deproteinization:improved extraction and purification of synthetic colorants from protein-rich food samples[J].Food Chemistry,2015,188(12):240-247.

[11]趙欣宇,文連奎.金紅蘋果醋飲料的加工工藝研究[J].飲料工業(yè),2008(4):39-42.

[12]L Solieri,P Giudici.Yeasts associated to traditional balsamic vinegar: ecological and technological features[J].International Journal of Food Microbiology,2008,125:36-45.

[13]許凱揚,熊詩璇,陳璇,等.蘋果果醋加工過程的發(fā)酵工藝研究[J].食品與機械,2011(3):130-132.

[14]許超群,王亞利,黃從軍,等.蘋果醋的開發(fā)與研究綜述[J].中國調(diào)味品,2011,36(2):7-10.

TheChangeRuleofMalicAcidContentintheBrewingProcessofAppleVinegar

XU Yan-jun, HAO Lin*

(College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

With fresh Fushi apple as raw material to brew apple vinegar, explore the change rule of malic acid content in each process of apple vinegar as apple juice through alcoholic fermentation and acetic acid fermentation.In this paper, ultraviolet spectrophotometry method is used to determine the content of malic acid,the results show that under the alcohol fermentation and acetic acid fermentation conditions,the malic acid content shows gradually decline rule:when alcohol fermentation by yeast SH221,the content of malic acid reduces from 14.975 mg to 2.35 mg, the descent rate is 84.31%；when alcohol fermentation by yeast SH222,the content of malic acid reduces from 14.975 mg to 2.06 mg, the descent rate is 86.24%.Thus expound the change rule of malic acid content in the whole brewing process of apple vinegar.

apple vinegar；apple acid；alcoholic fermentation；acetic acid fermentation；UV spectrophotometry method

TS264.22

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.011

1000-9973(2017)12-0054-04

2017-06-15 *通訊作者

許艷俊(1994-)，女，山西祁縣人，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

郝林(1957-)，男，山西太谷人，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。