黃巍，王建清，張倩

(1.天津科技大學(xué) 中國輕工業(yè)食品包裝材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300222；2.中國包裝科研測試中心，天津 300457)

香旱芹精油對金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)理的研究

黃巍1,2，王建清1，張倩1

(1.天津科技大學(xué) 中國輕工業(yè)食品包裝材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300222；2.中國包裝科研測試中心，天津 300457)

采用微波輔助水蒸氣蒸餾提取出香旱芹精油，對其成分進(jìn)行GC-MS分析，通過測試其對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑、最低抑菌濃度(MIC) 和最低殺菌濃度(MBC) 評價(jià)其抑菌效果。分別從菌體微觀形態(tài)、細(xì)胞溶出物、蛋白質(zhì)和鉀離子泄漏等方面研究香旱芹精油對金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香旱芹精油的主要成分為百里香酚(45.85%)、對傘花烴(20.72%)和γ-松油烯(23.57%)，其對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為75 mm，MIC為0.25 μL/mL，MBC為0.5 μL/mL。香旱芹精油可使金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜受到損傷，使細(xì)胞膜表面出現(xiàn)塌陷和破裂，并引起菌體細(xì)胞溶出物、蛋白質(zhì)以及鉀離子的泄露，從而導(dǎo)致菌體的死亡。

香旱芹精油；微波輔助水蒸氣蒸餾；GC-MS分析；金黃色葡萄球菌；抑菌機(jī)理

隨著人們對食品安全的關(guān)注程度日漸提升，傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑處理生鮮農(nóng)產(chǎn)品來延長其貨架壽命由于化學(xué)防腐劑的殘留和遷移問題對人體健康造成很大的安全隱患[1]，因此開發(fā)安全，高效可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)防腐劑的綠色天然抗菌劑成為人們?nèi)找骊P(guān)心的問題。近年來的一些研究成果表明：植物源抗菌劑對食源性致病菌具有廣譜抑菌效果[2,3]。

香旱芹又名印度藏茴香，現(xiàn)主要分布在中亞、印度和我國新疆和田地區(qū)。香旱芹在印度主要用作一種烹飪調(diào)料，在我國是一種藏藥成分，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腹瀉等的治療。香旱芹精油在國外的文獻(xiàn)中有初步報(bào)道它的抑菌效果[4]，它是如何實(shí)現(xiàn)抑菌和殺菌功能，特別是作用靶向部位的確定目前還不清楚。本文以金黃色葡萄球菌為供試菌，從細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)形態(tài)變化、細(xì)胞溶出物泄漏、蛋白質(zhì)釋放、鉀離子釋放等方面研究香旱芹精油對其的抑菌機(jī)理，為開發(fā)綠色安全的植物源防腐保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

香旱芹果實(shí)：原產(chǎn)地印度，網(wǎng)上采購。

實(shí)驗(yàn)菌種：金黃色葡萄球菌，由天津科技大學(xué)菌種保藏中心提供。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-2700 紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；PinAAcle 900T原子吸收光譜儀 美國PerkinElmer公司； SU-1510 掃描式電子顯微鏡 日本日立公司；Varian 4000MS GC-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國瓦里安公司； CHA-SA氣浴恒溫振蕩器 普瑞斯機(jī)械有限公司；全自動高壓滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；H-1650高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司； SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司; ORW1.5S-3E微波動態(tài)萃取設(shè)備 南京澳潤微波科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微波輔助水蒸氣蒸餾提取香旱芹精油

準(zhǔn)確稱取100.0 g香旱芹果實(shí)粉末與蒸餾水按1∶20的料液比混合，置于微波動態(tài)萃取設(shè)備料桶中，微波功率為600 W，溫度設(shè)為105 ℃，在微波萃取設(shè)備上接揮發(fā)油提取器，待提取結(jié)束后，收集蒸餾出的精油，無水硫酸鈉脫水，稱量，計(jì)算提取率。

1.3.2 抑菌效果測試

1.3.2.1 抑菌圈測試

參考張赟彬等[5]的方法，采用濾紙片擴(kuò)散法測試抑菌圈直徑。向直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中導(dǎo)入15 mL已滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，加入100 μL濃度為 1×107cfu/mL的菌懸液，無菌涂布棒均勻涂布。在培養(yǎng)皿中央放置1個直徑為6 mm的無菌濾紙片，在濾紙片上添加10 μL香旱芹精油。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中 37 ℃培養(yǎng) 24 h后測試抑菌圈直徑。以空白無菌濾紙片作為對照組。

1.3.2.2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測試

采用對倍稀釋法用無菌營養(yǎng)肉湯將香旱芹精油稀釋成一系列的濃度，每支試管中營養(yǎng)肉湯和香旱芹精油混合液的體積為10 mL，然后加入50 μL菌液。將試管置于37 ℃，120 r/min 搖床培養(yǎng) 24 h。上述試管中肉眼觀察到的未渾濁的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC)。從未渾濁的試管中取出50 μL菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基之上，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 24 h之后培養(yǎng)皿中無細(xì)菌生長的最低濃度為最低殺菌濃度(MBC)。

1.3.3 精油的GC-MS分析

參考丁華等[6]的實(shí)驗(yàn)方法并稍做修改。

氣相色譜條件：柱子型號VF-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度300 ℃，柱子流速1 mL/min，載氣He；程序升溫：初始溫度60 ℃，先以5 ℃/min升到200 ℃，再以10 ℃/min升到300 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)量分析器為離子阱，阱溫220 ℃，傳輸線溫度280 ℃，掃描方式為full/SIS，掃描范圍43～500 amu。

取精油用色譜級正己烷稀釋1000倍，取0.4 μL進(jìn)樣。檢索NIST 10標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)確認(rèn)精油的各個化學(xué)成分。按面積歸一化法計(jì)算各成分含量。

1.3.4 抑菌機(jī)理測試

1.3.4.1 掃描電鏡(SEM)觀察菌體結(jié)構(gòu)

采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察精油對金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)的影響，參考Han等[7]的方法并做適當(dāng)修改。將金黃色葡萄球菌的菌懸液培養(yǎng)至生長對數(shù)期，調(diào)節(jié)其濃度為1×108cfu/mL。將香旱芹精油以3種不同濃度[0(對照組)，1MIC和2MIC]加入到調(diào)節(jié)完濃度的菌懸液中，將加完精油的菌懸液置于搖床中培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)1 h后，從每份試樣中取出2 mL細(xì)菌懸浮液，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。 然后將收集的細(xì)胞用50%水/乙醇溶液洗滌2次。然后將20 μL懸浮液涂布在蓋玻片(1 cm×1 cm)上，并將100 μL含有體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液(用磷酸鹽緩沖液稀釋)加入到蓋玻片上固定2～3 h，然后進(jìn)行噴金和SEM觀察。

1.3.4.2 細(xì)胞溶出物泄漏測試

參考Turgis等[8]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，對菌懸液的上清液中的細(xì)胞溶出物進(jìn)行測試。菌種活化及菌懸液制備的操作方法同1.3.4.1。將菌懸液以4000 r/min離心15 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次，然后重懸于初始體積的無菌生理鹽水中。 將體積為25 mL的細(xì)菌懸浮液的等分試樣分別加入3種濃度的精油[0(對照組)，1MIC和2MIC]，在氣浴恒溫振蕩器中37 ℃培養(yǎng)。分別在0，1，2 h將混合物以4000 r/min離心15 min，使用UV-可見分光光度計(jì)在260 nm波長條件下測量3 mL上清液的吸光度值。

1.3.4.3 蛋白質(zhì)泄漏測試

參考He Mengying等[9]的方法測試細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏，并做適當(dāng)修改。通過測試細(xì)菌懸浮液上清液的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行蛋白質(zhì)泄漏測試。使用考馬斯亮藍(lán)法和紫外可見分光光度計(jì)在595 nm測定上清液中蛋白質(zhì)的含量。 從標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白曲線計(jì)算釋放的蛋白質(zhì)的量。

1.3.4.4 鉀離子泄漏測試

參考Miao等[10]的方法并做適當(dāng)修改，測量細(xì)菌懸浮液上清液中鉀離子的濃度。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的540 mL菌懸液以4000 r/min離心15 min收集菌體，然后用無菌生理鹽水溶液(0.85%光譜純NaCl，超純水稀釋)洗滌3次，重懸于540 mL無菌生理鹽水中，分成60 mL等分試樣9份。將懸浮液等分試樣加入3種不同濃度[0(對照組)，1MIC和2MIC]的香旱芹精油在搖床中37 ℃培養(yǎng)。在0，0.5，1，2，3，4 h分別取出10 mL樣品以4000 r/min離心15 min，收集1 mL上清液。用超純水將1 mL樣品稀釋10倍。使用原子吸收分光光度計(jì)測量上清液的鉀離子濃度。

1.3.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007進(jìn)行實(shí)驗(yàn)圖表的繪制，采用SPSS 17.0軟件中的T檢驗(yàn)和ANOVA進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為存在顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 香旱芹精油的化學(xué)成分分析

經(jīng)過微波輔助水蒸氣蒸餾提取的香旱芹精油的得率為4.4%。香旱芹精油的GC氣相色譜圖見圖1。

圖1 香旱芹精油的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of ajowan essential oil

通過 GC-MS 計(jì)算機(jī)檢索、人工解析譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜對比，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[11,12]，對譜圖進(jìn)行解析，最終鑒定出了16種成分，占總量的97.18%，其中香旱芹精油的主要成分為百里香酚45.85%，對傘花烴20.72%，γ-松油烯23.57%，β-蒎烯4.53%，丁香酚0.7%，本實(shí)驗(yàn)提取的香旱芹精油主要成分與參考文獻(xiàn)比較接近。

2.2 香旱芹精油的抑菌效果

香旱芹精油對經(jīng)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為75 mm，抑菌圈直徑的抗菌效力一般可以分為3個水平[13]：強(qiáng)抑菌活性：抑菌圈直徑≥20 mm；中等抑菌活性：12 mm<抑菌圈直徑<20 mm；弱抑菌活性：抑菌圈直徑≤12 mm。香旱芹精油75 mm的抑菌圈直徑顯著地高于一般抗菌劑的抑菌圈直徑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，這說明它具有超強(qiáng)的抑菌能力。香旱芹精油的MIC為0.25 μL/mL，MBC為0.5 μL/mL，較低濃度的MIC和MBC也證實(shí)了其對金黃色葡萄球菌的強(qiáng)抑制作用。

2.3 香旱芹精油對金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理分析

2.3.1 香旱芹對細(xì)菌細(xì)胞膜形態(tài)變化的影響

圖2 經(jīng)香旱芹精油處理1 h后的金黃色葡萄球菌掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 The SEM pictures of Staphylococcus aureus treated with ajowan essential oil for 1 h

圖2(a)為未經(jīng)過香旱芹精油處理的金黃色葡萄球菌的SEM圖片，未經(jīng)香旱芹精油處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞顯示圓球狀，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且表面光滑。圖2(b)是經(jīng)1MIC香旱芹精油處理60 min后的金黃色葡萄球菌的SEM圖片，部分金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜受到損傷，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)了褶皺和局部塌陷。圖2(c)是經(jīng)過2MIC香旱芹精油處理60 min后的金黃色葡萄球菌的SEM圖片，與經(jīng)過IMIC處理過的金黃色葡萄球菌相比，隨著精油濃度的增加，2MIC香旱芹精油對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的破壞程度更大，細(xì)胞的塌陷和破裂變得更加嚴(yán)重。Shi Ce等[14]報(bào)道了nisin與肉桂醛協(xié)同作用改變了金黃色葡萄球菌的外部結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致細(xì)胞壁退化和高度的細(xì)胞裂解。本文觀察到的經(jīng)香旱芹精油處理過的金黃色葡萄球菌的細(xì)胞發(fā)生了與上述文獻(xiàn)中類似的情況。

2.3.2 香旱芹精油對金黃色葡萄球菌細(xì)胞溶出物釋放的影響

在260 nm處吸收的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和核酸，上清液在260 nm的光密度值是細(xì)胞膜破裂和內(nèi)部細(xì)胞成分釋放的指示[15]。不同濃度的香旱芹精油處理金黃色葡萄球菌0，1，2 h后OD260值見圖3。

圖3 不同濃度的香旱芹精油對金黃色葡萄球菌細(xì)胞溶出物的影響Fig.3 The effect of different concentration of ajowan essential oil on the release of cell constituents from S. aureus

與未加入香旱芹精油的對照組相比，隨著時間和精油濃度的增加，260 nm的光密度值增加。精油作用2 h后，用2MIC 香旱芹精油處理的大腸桿菌細(xì)胞觀察到的最大OD260為0.556，用1MIC香旱芹精油處理的細(xì)胞的最大OD260為0.258，而此時對照組的OD260值僅為 0.071，可見香旱芹精油可以顯著增加金黃色葡萄球菌細(xì)胞溶出物的釋放(P<0.05)。Shen Suxia等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌經(jīng)過1MIC的肉桂醛處理后，其在260 nm下的吸光度值明顯增加，并且當(dāng)肉桂醛的濃度增加至4MIC時，其OD260繼續(xù)增加。Ajiboye T O等[17]發(fā)現(xiàn)丁香提取物同樣也造成了金黃色葡萄球菌菌懸液中260 nm波長下的吸光度值的上升，并且這一現(xiàn)象隨著丁香提取物濃度的增加變得更加明顯。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象相吻合，這說明香旱芹精油可以造成金黃色葡萄球菌的細(xì)胞溶出物的泄漏。

2.3.3 香旱芹精油對金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)釋放的影響

不同濃度的香旱芹精油對金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)釋放的影響見表1。

表1 不同濃度的香旱芹精油對金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)釋放的影響Table 1 The effect of different concentration of ajowan essential oil on the release of protein from S. aureus mg/L

用1MIC 香旱芹精油處理的金黃色葡萄球菌溶液的上清液中的蛋白質(zhì)濃度比對照中有顯著提升(P<0.05)。處理1 h后，對照組中的蛋白質(zhì)釋放僅為1.79 mg/L，而用1MIC和2MIC香旱芹精油處理的金黃色葡萄球菌樣品中，其分別為4.03 mg/L和5.97 mg/L。劉笑宇也報(bào)道了肉桂精油處理可以明顯增加金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)泄漏量[18]。這說明香旱芹精油可以造成金黃色葡萄球菌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的泄漏，這一現(xiàn)象隨著精油濃度的增加破壞作用更明顯。

2.3.4 香旱芹精油對金黃色葡萄球菌鉀離子釋放的影響

香旱芹精油對膜功能的影響之前已通過測定細(xì)胞溶出物和蛋白質(zhì)的滲漏來評價(jià)。當(dāng)微生物暴露于抗生素或一些其他不適當(dāng)?shù)纳L環(huán)境時，微生物細(xì)胞膜被破壞，并且細(xì)胞膜的滲透性變化可能導(dǎo)致電解質(zhì)例如鉀離子從細(xì)胞內(nèi)部泄漏。因此，鉀離子釋放測定法是研究抗微生物活性的有用手段，在本實(shí)驗(yàn)中通過對鉀離子釋放量的測試用于進(jìn)一步評價(jià)抗菌劑對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的影響。

3種不同濃度[0(對照組)，1MIC和2MIC]的香旱芹精油處理對金黃色葡萄球菌細(xì)胞釋放的鉀離子的影響結(jié)果見圖4。

圖4 香旱芹精油對金黃色葡萄球菌鉀離子釋放的影響Fig.4 The effect of ajowan essential oil on the release of potassium ions from S. aureus

在對照組中，金黃色葡萄球菌懸浮液中鉀離子的細(xì)胞外濃度隨時間緩慢升高，4 h后達(dá)到0.32 mg/L。用香旱芹精油處理的金黃色葡萄球菌懸浮液中的鉀離子的細(xì)胞外濃度顯著高于對照組(P<0.05)，并隨時間增加而緩慢增大。用1MIC香旱芹精油處理的細(xì)菌懸浮液中的鉀離子濃度在4 h后分別達(dá)到最大值1.22 mg/L，顯著高于對照組(P<0.05)；當(dāng)香旱芹精油的濃度上升到2MIC時，菌懸液中鉀離子濃度達(dá)到1.35 mg/L，顯著高于對照組(P<0.05)。Vivek K Bajpai[19]也得到了與本實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)枸杞果實(shí)精油可以破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的阻隔性，導(dǎo)致鉀離子泄漏的增加。

3 結(jié)論

本文采用微波輔助水蒸氣蒸餾提取出了香旱芹精油，提取得率為4.4%，其主要成分為百里香酚(45.85%)、對傘花烴(20.72%) 和γ-松油烯(23.57%)。香旱芹精油對金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)抑制作用，抑菌圈直徑為75 mm，MIC為0.25 μL/mL，MBC為0.5 μL/mL。香旱芹精油對金黃色葡萄球菌的抑菌作用方式在于破壞了金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜表面出現(xiàn)塌陷和破裂，并引起了金黃色葡萄球菌細(xì)胞溶出物、蛋白質(zhì)以及鉀離子的泄露和釋放，從而最終導(dǎo)致了菌體的死亡。

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StudyontheAntibacterialMechanismofAjowanEssentialOilAgainstStaphylococcusaureus

HUANG Wei1,2, WANG Jian-qing1, ZHANG Qian1

(1.China Light Industry Key Laboratory of Food Packaging Materials and Technology, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300222,China;2.China Packaging Research & Test Center,Tianjin 300457,China)

Ajowan essential oil is extracted by microwave assisted steam distillation, and its chemical composition is analyzed by GC-MS.The inhibitory diameter,minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of ajowan essential oil againstStaphylococcusaureusare tested by agar diffusion method and dilution method.The antibacterial mechanism of ajowan essential oil againstS.aureusis studied by exploring the scanning electron microscopy (SEM) image ofS.aureus, the leakage of cell constituents, protein and potassium ion.The results show that the main components of ajowan essential oil are thymol (45.85%),p-cymene( 20.72%) and γ-terpinene(23.57%), which have a strong inhibitory effect onS.aureus,the diameter of inhibition zone is 75 mm, the MIC is 0.25 μL/mL and the MBC is 0.5 μL/mL. Ajowan essential oil can destroy the cell membrane ofS.aureus, and its cell membrane surface appears folds and local collapse, resulting in the leakage of cell constituents, protein and potassium ion,leading to the death of bacteria.

ajowan essential oil;microwave assisted steam distillation;GC-MS analysis;Staphylococcusaureus;antibacterial mechanism

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.002

1000-9973(2017)12-0007-05

2017-06-23

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD16B05-02)

黃巍(1982-)，男，湖南株洲人，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品綠色防腐保鮮技術(shù)和運(yùn)輸包裝技術(shù)。