楊穎諭，張李紅，羅賢勇，張建坤，李生強(qiáng)，龐國(guó)蓮，錢玉蓮

(曲靖市第一人民醫(yī)院，云南曲靖655000)

非小細(xì)胞肺癌組織miR-564表達(dá)變化及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系

楊穎諭，張李紅，羅賢勇，張建坤，李生強(qiáng)，龐國(guó)蓮，錢玉蓮

(曲靖市第一人民醫(yī)院，云南曲靖655000)

目的探討微小RNA-564(miR-564)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法選擇NSCLC患者43例，取手術(shù)切除的癌組織及其癌旁正常組織，采用qRT-PCR法檢測(cè)兩種組織中miR-564表達(dá)，并分析miR-564表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果NSCLC組織miR-564相對(duì)表達(dá)量為12.43±3.17，癌旁正常組織為21.76±4.49，二者比較P<0.01。以NSCLC組織miR-564相對(duì)表達(dá)量的平均值為截?cái)嘀?，將患者分為miR-564低表達(dá)者21例、miR-564高表達(dá)者22例。miR-564表達(dá)與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、吸煙、組織類型、組織分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。miR-564高表達(dá)者總生存期為(40±28)個(gè)月、無(wú)病生存期為(42±25)個(gè)月，miR-564低表達(dá)者分別為(38±25)、(40±23)個(gè)月；二者比較P均<0.05。結(jié)論NSCLC組織miR-564表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)變化與腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后有關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；微小RNA-564；細(xì)胞增殖

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，占肺癌總數(shù)的80%～85%[1]。盡管各種新興技術(shù)不斷用于治療NSCLC，但患者5年生存率仍然不超過(guò)15%[2]。劉月姣等[3]研究認(rèn)為，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與NSCLC患者預(yù)后差密切相關(guān)。因此，探尋敏感特異的腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)NSCLC早期診斷和預(yù)后評(píng)估意義重大。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，廣泛存在于多種生物體內(nèi)。既往研究證實(shí)，某些miRNA在人類惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，并通過(guò)調(diào)控一系列基因表達(dá)發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。miR-564是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中miR-564通過(guò)與其靶基因結(jié)合，發(fā)揮類似抑癌基因作用[4]。但目前關(guān)于miR-564表達(dá)與NSCLC的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察了NSCLC組織miR-564表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年6月～2012年8月曲靖市第一人民醫(yī)院收治的初診NSCLC患者43例。所有患者符合美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟2010年制定的NSCLC診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)[5]，并經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷。排除術(shù)前接受放療、化療或其他抗癌治療者，合并間質(zhì)性肺炎等其他肺部疾病者，妊娠期或哺乳期患者。其中，男28例、女15例，年齡(57±13)歲，有吸煙史25例；組織類型：鱗癌19例、腺癌24例，TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期22例；組織分化程度：低、中分化25例，高分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。本研究經(jīng)曲靖市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 miR-564表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取手術(shù)切除的NSCLC組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>3 cm，并經(jīng)病理檢查確認(rèn))，采用TRIzol法提取各組織總RNA，采用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)鑒定總RNA的濃度和純度合格。根據(jù)miR-564的反轉(zhuǎn)錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCA-TT-3′進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-564上游引物：5′-AAGGGGGCTATGGAAAGGCAA-3′，下游引物： 5′-AATCCACGATGAA-GGGATGCT-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATT-TGC-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：5×loading buffer 5 μL、MgCl21 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL、Tag酶0.125 μL，滅菌水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s、60 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，最后74 ℃延伸5 min。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-564相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。比較NSCLC組織及癌旁正常組織miR-564相對(duì)表達(dá)量。以NSCLC組織miR-564相對(duì)表達(dá)量的平均值為截?cái)嘀?，將NSCLC患者分為miR-564低表達(dá)者和高表達(dá)者，分析NSCLC組織miR-564表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 隨訪方法 通過(guò)電話、信件或門診等方式進(jìn)行隨訪，隨訪截至2017年2月18日，失訪12例。統(tǒng)計(jì)NSCLC患者總生存期(OS)、無(wú)病生存期(DFS)。DFS是指從隨機(jī)化臨床試驗(yàn)開(kāi)始至疾病復(fù)發(fā)或因任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。OS是指從隨機(jī)化臨床試驗(yàn)開(kāi)始至任何原因引起患者死亡的時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織及癌旁正常組織miR-564表達(dá)比較 NSCLC組織miR-564相對(duì)表達(dá)量為12.43±3.17，癌旁正常組織為21.76±4.49；二者比較P<0.01。

2.2 NSCLC組織miR-564表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-564低表達(dá)者21例，高表達(dá)者22例。NSCLC組織miR-564表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。

2.3 NSCLC組織miR-564表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 NSCLC患者miR-564高表達(dá)者OS為(40±28)個(gè)月、DFS為(42±25)個(gè)月，miR-564低表達(dá)者分別為(38±25)、(40±23)個(gè)月；二者比較P均<0.05。見(jiàn)圖1。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA主要通過(guò)與其靶基因mRNA的3′-UTR端互補(bǔ)結(jié)合降解mRNA或抑制mRNA翻譯，從而阻遏基因表達(dá)，參與機(jī)體的多種生物學(xué)行為，如早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等[6,7]。miRNA表達(dá)異常與惡性腫瘤關(guān)系密切，如miR-16在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)將細(xì)胞阻滯于G0/G1期而發(fā)揮類似抑癌基因作用[8]；miR-21在NSCLC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移，具有癌基因作用[9]。與其他類型腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物比較，miRNA具有穩(wěn)定性好、敏感性和特異性均較高等優(yōu)點(diǎn)，故其在腫瘤的早期診斷、病情預(yù)測(cè)、預(yù)后評(píng)估等方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

表1 NSCLC組織miR-564表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：A為NSCLC組織不同miR-564表達(dá)者OS比較；B為NSCLC組織不同miR-564表達(dá)者DFS比較。

圖1NSCLC組織miR-564表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

miR-564是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，正常情況下主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-564在惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中扮演重要角色?，F(xiàn)已證實(shí)，miR-564在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等組織中表達(dá)下調(diào)，并與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移密切相關(guān)[10～13]，具有類似抑癌基因的作用。推測(cè)miR-564有可能成為某些惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子生物學(xué)標(biāo)志。目前關(guān)于miR-564的作用機(jī)制尚不完全清楚。Jiang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-564能抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)，繼而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，其作用機(jī)制可能與阻斷TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)。Rokah等[15]研究發(fā)現(xiàn)，慢性髓系白血病患者外周血miR-564低表達(dá)，其表達(dá)變化與病情進(jìn)展密切相關(guān)；雷帕霉素靶蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、EGFR等可能均參與了miR-564介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織miR-564相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，提示在NSCLC中miR-564可能具有抑癌基因作用。Mutlu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織miR-564表達(dá)明顯低于正常乳腺組織，并與血管浸潤(rùn)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期和復(fù)發(fā)時(shí)間密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-564低表達(dá)與NSCLC患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-564表達(dá)越低，TNM分期越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大，與Chacolla-Huaringa等[16]研究結(jié)論基本一致。朱鵬沖等[17]研究認(rèn)為，組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素，推測(cè)miR-564亦可能與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)。為證實(shí)上述推測(cè)，本研究對(duì)NSCLC患者進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者miR-564高表達(dá)者OS、DFS均較miR-564低表達(dá)者明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明miR-564表達(dá)變化與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，NSCLC組織miR-564表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)變化與腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后有關(guān)；miR-564有可能成為NSCLC早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子生物學(xué)標(biāo)志之一。

[1] Grilley-Olson JE, Hayes DN, Moore DT, et al. Validation of interobserver agreement in lung cancer assessment: hematoxylin-eosin diagnostic reproducibility for non-small cell lung cancer: The 2004 World Health Organization classification and therapeutically relevant subsets[J]. Arch Pathol Lab Med, 2013,137(1):32-40.

[2] Jiang ZQ, Yang K, Komaki R, et al. Long-term clinical outcome of intensity-modulated radiotherapy for inoperable non-small cell lung cancer: The MD Anderson experience[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2012,83(1):332-339.

[3] 劉月姣，李曉敏,武靜,等.ⅢA(N2)期NSCLC術(shù)后預(yù)后因素分析[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志，2016，25(10)：1057-1061.

[4] Ohgino K, Soejima K, Yasuda H, et al. Expression of fibroblast growth factor 9 is associated with poor prognosis in patients with resected non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2014,83(1):90-96.

[5] 劉裔莎，魏兵，楊雯娟，等.美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)乳腺癌分期(第七版)簡(jiǎn)介[J].中華病理學(xué)雜志，2010，39(11)：787-790.

[6] 范博，張亮，馬馳，等.微小RNA與腫瘤發(fā)生的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，2012，34(6)：401-404.

[7] 謝小缺，王華，顧康生.胃癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA和微小RNA的相關(guān)研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，52(2)：301-303.

[8] Ke Y, Zhao W, Xiong J, et al. Downregulation of miR-16 promotes growth and motility by targeting HDGF in non-small cell lung cancer cells[J]. FEBS Lett, 2013,587(18):3153-3157.

[9] Li B, Ren S, Li X, et al. MiR-21 overexpression is associated with acquired resistance of EGFR-TKI in non-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2014,83(2):146-153.

[10] Yang B, Jia L, Guo Q, et al. MiR-564 functions as a tumor suppressor in human lung cancer by targeting ZIC3[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,467(4):690-696.

[11] Mutlu M, Saatci ?, Ansari SA, et al. miR-564 acts as a dual inhibitor of PI3K and MAPK signaling networks and inhibits proliferation and invasion in breast cancer[J]. Sci Rep, 2016(6):32541.

[12] Guo Y, Qi Y, Guo A, et al. miR-564 is downregulated in gastric carcinoma and targets E2F3[J]. Oncol Lett, 2017,13(6):4155-4160.

[13] Chu S, Wang H, Yu M. A putative molecular network associated with colon cancer metastasis constructed from microarray data[J]. World J Surg Oncol, 2017,15(1):115.

[14] Jiang C, Shen F, Du J, et al. MicroRNA-564 is downregulated in glioblastoma and inhibited proliferation and invasion of glioblastoma cells by targeting TGF-β1[J]. Oncotarget, 2016,7(35):56200-56208.

[15] Rokah OH, Granot G, Ovcharenko A, et al. Downregulation of miR-31, miR-155, and miR-564 in chronic myeloid leukemia cells[J]. PLoS One, 2012,7(4):e35501.

[16] Chacolla-Huaringa R, Moreno-Cuevas J, Trevino V, et al. Entrainment of breast cell lines results in rhythmic fluctuations of MicroRNAs[J]. Int J Mol Sci, 2017,18(7):E1499.

[17] 朱鵬沖，孫志鋼，肖偉，等.非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)后預(yù)后與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3的關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016，33(8)：1910-1912.

張建坤(E-mail： zhangjianknu@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.025

R734.2

B

1002-266X(2017)44-0078-03

2017-08-08)