宮瑩瑩，何玉，席玉玲

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233004)

PARP-1、Caspase-3在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化及意義

宮瑩瑩，何玉，席玉玲

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠233004)

目的探討多聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化及其臨床意義。方法收集子宮內(nèi)膜癌組織60例份、正常子宮內(nèi)膜組織20例份、子宮內(nèi)膜增生組織20例份，采用免疫組化法檢測各組織PARP-1、Caspase-3蛋白表達(dá)，分析子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1、Caspase-3表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系及二者的相關(guān)性。結(jié)果子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織PARP-1陽性表達(dá)率分別為73.33%、15.00%、45.00%，不同組織間PARP-1陽性表達(dá)率比較P<0.05或<0.01。子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織Caspase-3陽性表達(dá)率分別為41.67%、85.00%、45.00%，正常子宮內(nèi)膜組織Caspase-3陽性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜癌組織及子宮內(nèi)膜增生組織(P均<0.01)。子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1陽性表達(dá)與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度均有關(guān)(P均<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。子宮內(nèi)膜癌組織Caspase-3陽性表達(dá)與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P均>0.05)。子宮內(nèi)膜癌組織PARR-1、Caspase-3陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64，P<0.01)。結(jié)論子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低；PARP-1表達(dá)升高可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展。

子宮內(nèi)膜癌；多聚ADP核糖聚合酶1；半胱氨酸蛋白酶3

子宮內(nèi)膜癌占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%，其具體發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚[1]。多聚ADP核糖聚合酶1( PARP-1)是一種具有多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能的核酶，在DNA突變修復(fù)尤其是DNA單鏈斷裂修復(fù)，以及維持基因組穩(wěn)定性中具有至關(guān)重要的作用[3]。研究表明，PARP-1在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常[4～8]，其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系也逐漸成為研究熱點(diǎn)。半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)通路中起核心作用。激活Caspase-3可降解多種酶底物，使級聯(lián)反應(yīng)效應(yīng)增強(qiáng)，從而使細(xì)胞完成凋亡的全過程。PARP-1作為Caspase最重要的酶底物，參與其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，兩者的協(xié)同作用在凋亡機(jī)制中具有重要作用，但兩者在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化及其臨床意義鮮見報(bào)道。為此我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010～2013年于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者60例，術(shù)中收集其子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本。患者均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，術(shù)前均未經(jīng)放療、化療或免疫治療。年齡35～68歲，平均52歲；臨床分期參照2009年FIGO手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期37例，Ⅱ期19例，Ⅲ期4例；分化程度按FIGO組織分化標(biāo)準(zhǔn)：高分化22例，中分化32例，低分化6例；浸潤深度：<1/2肌層21例，≥1/2肌層39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。選取同期經(jīng)手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜增生患者20例，年齡36～55歲，平均45歲，術(shù)中取其正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織各20例份。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者均知情同意。

1.2 組織PARP-1、Caspase-3檢測 采用免疫組化法。將子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織標(biāo)本采用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片。采用免疫組化法檢測組織PAPR-1、Caspase-3表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。兔抗人PARP-1多克隆抗體工作濃度為1∶50，鼠抗人Caspase-3單克隆抗體工作濃度為1∶200， DAB顯色，蘇木素復(fù)染。采用IgG代替一抗作為陰性對照，用已知相應(yīng)蛋白陽性切片作為陽性對照。PARP-1陽性染色為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞核；Caspase-3陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，亦可見于細(xì)胞核和細(xì)胞核膜。所有切片由我院兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行觀察，在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)陽性細(xì)胞較多的視野觀察染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。染色強(qiáng)度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比評分相乘≥3為陽性表達(dá)，<3為陰性表達(dá)。

1.3 子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1、Caspase-3表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 收集子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理參數(shù)，包括臨床分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分析子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1、Caspase-3表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)。PARP-1與Caspase-3的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織PARP-1、Caspase-3表達(dá)比較 子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織PARP-1陽性表達(dá)率分別為73.33%(44/60)、15.00%(3/20)、45.00%(9/20)，不同組織間PARP-1陽性表達(dá)率比較P<0.05或<0.01。子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織Caspase-3陽性表達(dá)率分別為41.67%(25/60)、85.00%(17/20)、45.00%(9/20)，正常子宮內(nèi)膜組織Caspase-3陽性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜癌組織及子宮內(nèi)膜增生組織(P均<0.01)。

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1、Caspase-3表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1陽性表達(dá)與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度均有關(guān)(P均<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。子宮內(nèi)膜癌組織Caspase-3陽性表達(dá)與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1、Caspase-3表達(dá)的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織PARR-1、Caspase-3陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64，P<0.01)。

3 討論

PARP是在真核細(xì)胞中催化聚二磷酸腺苷核酸糖化產(chǎn)生的一種蛋白翻譯后修飾酶，參與DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄、維持染色體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)過程。PARP-1作為PARP家族中最重要的成員，是其中發(fā)揮主要作用的亞基。Barnett等[10]研究顯示，晚期漿液性卵巢癌細(xì)胞PARP-1表達(dá)明顯升高，且腫瘤細(xì)胞分化程度越低， PARP-1表達(dá)越高。分析原因：①腫瘤細(xì)胞增殖活躍，產(chǎn)生大量過氧化物如NO、氧自由基等，造成DNA損傷， DNA雙鏈出現(xiàn)缺口或斷裂，使得PARP-1立即活化，DNA損傷越重，產(chǎn)生的DNA斷端越多， PARP-1表達(dá)越高[11]；②DNA斷端增多甚至出現(xiàn)不規(guī)則DNA斷裂，故在細(xì)胞修復(fù)過程中出現(xiàn)的錯(cuò)配修復(fù)比例也明顯增高，PARP-1表達(dá)也隨之升高；③ 過量DNA損傷在引起PARP-1活化的同時(shí)，降低了其對DNA 的修復(fù)活性，故分化程度越低的細(xì)胞PARP-1表達(dá)越高。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生組織PARP-1陽性表達(dá)率依次降低，子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1陽性表達(dá)率與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度均有關(guān)；說明子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1表達(dá)升高，并參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1、Caspase-3表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

細(xì)胞凋亡對于促進(jìn)生物體進(jìn)化、保證器官組織正常發(fā)育、維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及免疫系統(tǒng)的正常功能均具有重要作用，細(xì)胞凋亡途徑可分為Caspase依賴途徑和非Caspase依賴途徑，其中以前者更為重要[9]。細(xì)胞凋亡可以有效預(yù)防腫瘤發(fā)生，對腫瘤細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用。正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞若出現(xiàn)凋亡通路紊亂、促凋亡因子表達(dá)抑制、凋亡抑制因子過度表達(dá)及凋亡基因表達(dá)失控等，均可導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失衡，引起腫瘤的發(fā)生。Caspase-3作為Caspase家族的重要成員之一，實(shí)質(zhì)為含有半胱氨酸的蛋白酶，以無活性的酶原形式存在于多個(gè)人體器官正常組織細(xì)胞中，位于細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)主要通路的核心位置。當(dāng)Caspase-3酶原被多種凋亡刺激因子啟動(dòng)不同的蛋白酶切割時(shí)，Caspase-3即被激活，活化的Caspase-3可水解相應(yīng)底物，并通過蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)放大誘發(fā)凋亡。凋亡的途徑大致分為：①線粒體/細(xì)胞色素c介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路；②Fas死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路。無論哪一種凋亡途徑最終過程都是通過激活Caspase-3完成的，其為細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，被稱為死亡蛋白酶[12]。Zanotti等[13]報(bào)道，Caspase-3在正常宮頸上皮細(xì)胞、上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞、浸潤癌細(xì)胞中的表達(dá)依次降低，提示Caspase-3表達(dá)降低可能參與宮頸上皮細(xì)胞的惡變過程。于紅麗等[14]報(bào)道，Caspase-3在卵巢癌組織中的陽性率僅為0.5%，而在良性卵巢腫瘤及交界性卵巢上皮性腫瘤的陽性表達(dá)率均為100%，提示Caspase-3激活可能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，避免卵巢癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織及子宮內(nèi)膜增生組織Caspase-3陽性表達(dá)率均低于正常子宮內(nèi)膜組織；推測腫瘤細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)降低，其活性缺失可能使腫瘤細(xì)胞在形成過程中逃避機(jī)體細(xì)胞凋亡的自我調(diào)節(jié)而不斷增殖，細(xì)胞凋亡與增殖之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織Caspase-3陽性表達(dá)率與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)；說明Caspase-3可能僅參與了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡失衡，并沒有參與組織間質(zhì)破壞和腫瘤細(xì)胞的黏附侵襲，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷時(shí)，PARP-1被活化后識別損傷位點(diǎn)，催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解為尼克酰胺和ADP核糖，進(jìn)而合成為長鏈聚腺苷二磷酸核糖(PAR)，與PARP-1自身、p53、DNA連接酶、組蛋白等多種核受體蛋白共價(jià)結(jié)合，使其發(fā)生聚ADP核糖化而增加其活性。此后，PARP-1從DNA上釋放，使DNA修復(fù)酶結(jié)合到DNA斷裂處進(jìn)行DNA修復(fù)。但當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重時(shí)， PARP-1被過度活化，其“細(xì)胞保護(hù)”功能即發(fā)生改變，為防止核蛋白過度聚二磷酸腺苷核糖化，導(dǎo)致NAD+和ATP大量消耗，此時(shí)將激活Caspase-3，PARP-1就成為Caspase-3 的“死亡底物”而被裂解，保證細(xì)胞凋亡的正常進(jìn)行。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織PARR-1、Caspase-3陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)。理論上子宮內(nèi)膜癌組織由于細(xì)胞損傷嚴(yán)重，PARP-1被大量激活，為避免腫瘤細(xì)胞過度增殖，Caspase-3也應(yīng)被激活；但事實(shí)上子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)降低，阻斷了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，使腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加。因此，子宮內(nèi)膜癌組織PARR-1、Caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。PARP-1過度表達(dá)引起Caspase-3表達(dá)降低的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織PARP-1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低；PARP-1表達(dá)升高可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展。

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