張春艷，劉瑞駒，何偉彬，劉柏威，李海燕*

（1．廣東國方醫(yī)藥科技有限公司，廣東 東莞 523000；2．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000）

不同破壁工藝對鐵皮石斛性狀和功效成分結(jié)構(gòu)的影響研究

張春艷1，劉瑞駒1，何偉彬1，劉柏威1，李海燕2*

（1．廣東國方醫(yī)藥科技有限公司，廣東 東莞 523000；2．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000）

本研究主要討論3種鐵皮石斛粉破壁工藝生產(chǎn)的粉之間及與原藥材鐵皮石斛鮮條在感官形態(tài)、破壁效果的差異，不同破壁工藝是否對反映產(chǎn)品質(zhì)量的物理常數(shù)黏度產(chǎn)生影響。研究認(rèn)為溫度、破壁方式對鐵皮石斛的物理性狀會產(chǎn)生很大的影響，經(jīng)三聯(lián)破壁法工藝生產(chǎn)的的鐵皮石斛粉能最大限度的保持原藥材功效成分結(jié)構(gòu)。

破壁；破壁中藥飲片；未破壁細(xì)胞數(shù)；黏度；三聯(lián)低溫破壁法；多糖；膠體結(jié)構(gòu)

鐵皮石斛：又名黑節(jié)草，是多年、叢生性蘭科草本植物，常以莖條為藥用部分。其主要功效成分為鐵皮石斛多糖、甘露糖，另含有豐富的生物總黃酮、鈣、鎂、磷等礦物質(zhì)和B族維生素。鐵皮石斛傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝較為落后，多為其直接烘干切小節(jié)段、或卷曲成螺旋狀稱之為楓斗或鮮條榨汁服用。隨著中藥現(xiàn)代化發(fā)展和生產(chǎn)工藝的進(jìn)步，特別是破壁中藥飲片的興起，使鐵皮石斛得到更好的的開發(fā)和利用。本文主要討論3種鐵皮石斛粉破壁工藝生產(chǎn)的粉之間及原藥材鐵皮石斛鮮條在感官形態(tài)、破壁效果（未破壁細(xì)胞數(shù)和內(nèi)容物鑒別）上的差異，不同破壁工藝是否對功效成分的含量、粉體物理性狀產(chǎn)生影響。

1 定 義

1.1 多糖（Polysaccharide）

是許多單糖分子縮合而成的長鏈結(jié)構(gòu)，分子量都很大，在水中不能成真溶液，形成膠體甚至不溶于水，均無甜味，也無還原性。作為動植物的主要結(jié)構(gòu)支持物質(zhì)和主要能量來源，還具有復(fù)雜的多方面生物活性與功能。多糖的糖鏈能控制細(xì)胞的分裂與分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老。特別是多糖作為廣譜免疫調(diào)節(jié)劑可用于免疫性疾病的治療[1]。

1.2 破壁飲片的定義

中藥破壁飲片是將符合《中國藥典》要求并具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的植物類中藥飲片經(jīng)現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)加工至D90（45 μm）300目以上的粉體，加水或不同濃度的乙醇粘合成型，制成30～100目的原飲片全成分的均勻干燥顆粒狀飲片[3]。

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 樣品來源

鐵皮石斛鮮條（批號：GF20170401）由廣東國方醫(yī)藥科技有限公司提供。

2.2 樣品破壁

三聯(lián)低溫破壁法：由濕法粉碎破壁、超高靜壓破壁和超低溫冷凍破壁工藝路線組成，將鮮條用臭氧水清洗滅菌，利用高壓水射流設(shè)備對鐵皮石斛進(jìn)行粉碎，將鐵皮石斛漿液轉(zhuǎn)移到高壓設(shè)備進(jìn)行增壓至5*105～6*105kPa，保持壓力時間為5～25 min，然后離心濃縮，將濃縮液進(jìn)行真空低溫冷凍干燥（具體見發(fā)明專利：一種可直接口服中藥飲片鐵皮石斛粉的制備方法，申請?zhí)柣驅(qū)＠枺?01610990451.3）[2]得鐵皮石斛粉A（簡稱粉A）。

濕法粉碎破壁：取鐵皮石斛鮮條，用刀切成3～5 cm長度的段，清洗，按照1：20加入溫水（60～80℃），啟動打漿機(jī)，轉(zhuǎn)速10000～20000 r·min-1，持續(xù)一定時間后停止（具體根據(jù)不同型號的生產(chǎn)設(shè)備說明操作），反復(fù)多次至無顆粒、完整的段存在，過300目濾網(wǎng)，收集濾液；殘?jiān)煞磸?fù)打漿。將濾液離心濃縮成30%～40%左右的濃漿，干燥進(jìn)風(fēng)溫度保持180℃，噴霧干燥得鐵皮石斛粉B（簡稱粉B）。

干法粉碎破壁：取鐵皮石斛鮮條，用刀切成3～5 cm長度的段，清洗，80～100℃烘干至水分≤5%，用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過300目篩網(wǎng)，反復(fù)多次粉碎，收集粉末，得鐵皮石斛粉C（簡稱粉C）。

2.3 檢測

檢測根據(jù)以上方法進(jìn)行破壁處理后得到的粉的感官形狀、未破壁細(xì)胞數(shù)、黏度和可溶性固形物以及對鮮條進(jìn)行顯微鏡鑒別和部分內(nèi)容物成分鑒別，從物理形狀指標(biāo)和功效成分指標(biāo)是否存在差異。檢驗(yàn)項(xiàng)目和結(jié)果見表1。

表1 感官形狀

2.4 未破壁細(xì)胞數(shù)

稱取供試品0.010 g，加入水合氯醛試液-水（1:1）0.5 ml，超聲至完全溶散，吸取所有溶液裝片，每片以不溢出、無氣泡、顆粒分布均勻?yàn)槎?，?00倍顯微鏡下檢視，移動玻片，計(jì)算每一個視野內(nèi)的大于100 um且完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顆粒個數(shù)（如多個完整的細(xì)胞連成一片，且整片也超過100 um的，以整片為一個計(jì)算）[4]。

由上圖分析：粉A未破壁細(xì)胞少，且未破壁細(xì)胞主要呈條索狀、不完整細(xì)胞組成的大于100 um的團(tuán)塊，顯微可見，具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)且大于100 um的單個細(xì)胞非常少，被粉碎的細(xì)胞壁纖維質(zhì)殘?jiān)６刃。稚⒕鶆?。粉B里含有的不成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的碎片多，具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)且大于100 um的單個細(xì)胞清晰可見，水溶膠質(zhì)狀的內(nèi)容物形成黑色團(tuán)塊、斑點(diǎn)多，團(tuán)、塊內(nèi)可能包裹了未破壁的細(xì)胞，也會影響實(shí)際的計(jì)數(shù)。粉C是楓斗粉碎，內(nèi)容物形成的黑色斑點(diǎn)、團(tuán)塊比粉B更多，顯微鏡下可見這些殘?jiān)w粒大小不一，且不能均勻分散，形成大片的包埋，實(shí)際未破壁細(xì)胞數(shù)可能更多。

采用同批次原料，在不同破壁-干燥工藝下，其顯微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出非常明顯的差異，同時顯微結(jié)構(gòu)圖從微觀上解釋了感官性狀差異產(chǎn)生的原因。采用專利技術(shù)生產(chǎn)的粉A形成的細(xì)胞壁纖維碎片非常細(xì)小，在溶液里均勻分散，分離性好，非完整破碎細(xì)胞組織少，超低溫冷凍干燥讓功效成分不受破壞，后續(xù)通過急劇的低溫-真空-升溫，水分急劇升華突破細(xì)胞壁，使內(nèi)容物分散均勻，且無任何異味。因此粉A沖泡后即使有少量細(xì)胞壁纖維沉淀形成，也能很快沉淀到底部。粉B采用噴霧干燥，瞬時高溫?zé)犸L(fēng)快速帶走水分，讓鐵皮石斛快速從液態(tài)—轉(zhuǎn)變成固態(tài)的過程，可實(shí)現(xiàn)破壁，但高溫讓鐵皮石斛多糖、甘露糖等分子物理構(gòu)像產(chǎn)生變化，B族維生素受高溫破壞，整體產(chǎn)生焦糊感異味。細(xì)胞內(nèi)部形成包埋團(tuán)塊，因此粉體在水中的分散性和溶出性變差，這些反饋到感官性狀判斷就形成口感粗糙、砂礫感、且膠質(zhì)感差的特質(zhì)。粉C雖然未受太高溫度、功效成分破壞沒有粉B嚴(yán)重，但未破壁細(xì)胞和非完全破壁細(xì)胞太多，有效成分溶出少。

2.5 內(nèi)容物的鑒別

鐵皮石斛粉體應(yīng)符合保留部分鐵皮石斛功效成分和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的要求。顯微鏡鑒別可見表皮細(xì)胞特性：外壁及側(cè)壁稍增厚、微木化，黏液細(xì)胞含草酸鈣針晶束[3]。

注：“+”代表陽性反應(yīng)程度，“-”代表陰性反映

結(jié)果可見，3種粉在反應(yīng)（1）中均無氣泡產(chǎn)生，粉A的針狀草酸鈣結(jié)晶析出量相對更多，說明黏液細(xì)胞破碎完全，內(nèi)容物草酸鈣針晶束析出完全。在細(xì)胞壁性質(zhì)鑒定中，粉A幾乎無色，說明木質(zhì)化細(xì)胞壁含量少，考慮是同一批鐵皮石斛鮮條樣品，其本身的表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)應(yīng)該一致，因此很明顯是粉A粉碎更徹底，殘留的細(xì)胞壁纖維更少或者更細(xì)。

2.6 黏度的測定

黏度是反映藥物物理結(jié)構(gòu)組成的物理常數(shù)，也可反映藥品的純度，是評價藥品質(zhì)量的主要指標(biāo)之一[4]。由鐵皮石斛多糖在水中分散形成水溶膠體，而目前還沒有研究可證明鐵皮石斛多糖分子量大小和結(jié)構(gòu)組成，由于多糖的活性與相對分子質(zhì)量、溶解度、黏度及結(jié)構(gòu)有關(guān)，一般來說，中相對分子質(zhì)量的多糖活性大于高分相對分子質(zhì)量及低相對分子質(zhì)量的多糖[5]。但是當(dāng)部分鐵皮石斛多糖大分子結(jié)構(gòu)被破壞成中小鏈分子時，多糖含量也可能不變。根據(jù)多次檢測結(jié)果可推斷，鐵皮石斛多糖含量與其黏度具有波動正相關(guān)性。因此不能單純以鐵皮石斛多糖含量來評判破壁鐵皮石斛的優(yōu)劣，應(yīng)增加黏度指標(biāo)，來測評被工藝處理過的鐵皮石斛，以確保鐵皮石斛多糖的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生理功效性。

樣品預(yù)處理（按照常規(guī)推薦服用方法，參考藥典和云南省標(biāo)[6]的檢測方法）

（1）準(zhǔn)確稱取3種粉各2.0 g，加150 ml60 ℃溫開水至九三道攪拌杯中，啟動攪拌杯讓水轉(zhuǎn)動起來形成旋渦狀，勻速將稱取得粉倒入攪拌杯中，保持?jǐn)噭?0 s（轉(zhuǎn)速約10000 r·min-1），形成均勻分散的液體，將溶液分成3份倒入燒杯中，用水浴保溫或冷卻至室溫，分別測80℃±2℃、60℃±2℃，40℃±2℃和室溫（25～30℃）待測。同樣方法制備3種樣品。

（2）準(zhǔn)確稱取同批次鮮條15 g，切成3～5 cm的小段，洗凈，放入榨汁機(jī)，然后加300 ml 60℃溫開水至榨汁機(jī)中，啟動榨汁機(jī)1 min，暫停，反復(fù)多次，過濾，收集濾液，按上述步驟（1）保留3份在不同溫度的樣品，待測。

樣品 80℃，mPa.s60℃，mPa.s40℃，mPa.s 室溫mPa.s粉A（1:75） 39 71 92 114粉B（1:75） 8 10 15 23粉C （1:75） 19 30 48 82鮮條（1:20） 22 42 58 77

2.7 測試方法[4]

通過將某種類型的轉(zhuǎn)子浸入待測樣品中，并以恒定的角速度（ω）轉(zhuǎn)動，測定馬達(dá)轉(zhuǎn)動的產(chǎn)生地扭矩（M），根據(jù)下列公式計(jì)算出待測樣品的粘度。通常情況下，轉(zhuǎn)子型黏度計(jì)常數(shù)K是通過采用標(biāo)準(zhǔn)黏度液校準(zhǔn)得到的，故測定結(jié)果為相對黏度。

注：轉(zhuǎn)子型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)配備的轉(zhuǎn)子

3 結(jié) 果

鐵皮石斛液（1：75）不同溫度下黏度值 mPa.s

解析：由上圖可以看出：粉A的膠黏度最高，在室溫至80℃的過程中。溫度越高，粘度越小，當(dāng)溫度超過80℃時，多糖大分子結(jié)構(gòu)易被破壞；如溫度過低（≤40℃），其黏度過高，容易形成包埋結(jié)構(gòu)，難以均勻分散，內(nèi)容物也難以充分溶出，因此建議在80℃～40℃范圍內(nèi)沖泡，25℃～40℃微溫?zé)岬臓顟B(tài)下飲用。使用同批次鐵皮石斛鮮條15 g按照1:20榨汁，其液體黏度比相當(dāng)量的2 g粉C的黏度稍低，粉B黏度最低，說明高溫讓其膠體結(jié)構(gòu)破壞最嚴(yán)重。粉A的鐵皮石斛多糖的分子物理結(jié)構(gòu)保持的最好。從黏度這個反映有效成分分子物理結(jié)構(gòu)的指標(biāo)來說，三聯(lián)破壁法的粉A能最大限度的保持原藥材功效成分。

3.1 本研究主要使用的設(shè)備、儀器

LP100噴霧干燥系統(tǒng)、TDL-4C離心機(jī)、九陽榨汁機(jī)、冷凍干燥罐、高壓水射流設(shè)備、臭氧發(fā)生器、真空濃縮罐、DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、B203生物顯微鏡、萬能粉碎機(jī)、九三道?攪拌杯、CQ-200超聲儀、NDJ-1S型數(shù)字式粘度計(jì)、EL-3200S電子天平和溫度計(jì)。

3.2 本研究主要使用的試劑

水合氯醛試液-水（1:1）、稀醋酸、硫酸、間苯三酚、鹽酸、純化水。

4 討 論

本研究分別對比了3份樣品（粉A、粉B、粉C）和鮮條的感官形狀、未破壁細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞內(nèi)容物鑒別和黏度，從單項(xiàng)解析來看，粉A各方面指標(biāo)都優(yōu)于其他兩個樣品，在黏度方面，粉A甚至優(yōu)于相當(dāng)量（干燥品折算）的鮮條，綜合說明粉A的破壁工藝不但使鐵皮石斛細(xì)胞壁最大程度的破碎，內(nèi)容物溶出量最多，而更重要的是其功效成分的大分子結(jié)構(gòu)未受破壞，保護(hù)了功效成分能在體內(nèi)發(fā)揮最大的作用。本研究同時也證明植物中藥材的破壁工藝方式很多，但要綜合全面考慮，破壁的目的不單是打破細(xì)胞壁、提高破壁率，也要考慮破壁后的內(nèi)容物成分是否會被下一步工藝破壞，在功效成分含量指定的檢測方法不能發(fā)現(xiàn)的情況下，要考慮增加用黏度、內(nèi)容物等指標(biāo)來進(jìn)行判斷。同時，高溫破壁、干燥等工藝會影響鐵皮石斛多糖的分子結(jié)構(gòu)，降低其含量。因此不建議繼續(xù)采用類似生產(chǎn)工藝。

[1]吳梧桐.生物化學(xué).第四版[M].人民衛(wèi)生出版社,2001:8,9-211.

[2]張春艷,盧續(xù)貞.一種可直接口服中藥飲片鐵皮石斛粉的制備方法[P].申請?zhí)柣驅(qū)＠?201610990451.3,2016

[3]廣東省藥檢所.廣東省中藥破壁飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究規(guī)范試行[S].2010:4,7-8.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].中國醫(yī)藥科技出版社,2015:282,283.

[5]王光亞.保健食品功效成分檢測方法[M].中國輕工業(yè)出版社,2002:17.

[6]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.《鐵皮石斛粉》云YPBZ 0191-201[S].昆食藥監(jiān)安〔2013〕3號,2013

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A

ISSN.2095-6681.2017.27.19.03

高品質(zhì)有機(jī)鐵皮石斛種植技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化和科普動漫化推廣，國家星火計(jì)劃面上項(xiàng)目，項(xiàng)目編號：2015GA780023

李海燕，副教授，Tel:（0757）82836985，E-mail：fswxlhy@163.com

本文編輯：吳宏艷