姚佳 饒國洲 李旭奎

BimS慢病毒RNA干擾載體的構(gòu)建及其感染效率和干擾效果的實驗研究

姚佳 饒國洲 李旭奎

目的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建BimS慢病毒RNA干擾載體,探討其感染效率和干擾效果。方法針對人BimS設(shè)計3 個干擾靶點，將單鏈引物退火成雙鏈oligo序列，連接入Age I和EcoR I雙酶切線性化載體中。將重組質(zhì)粒進行病毒包裝、并且通過感染ACC-2細(xì)胞觀察其感染效率，定量PCR檢測其對BimS mRNA干擾效果。結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)擴增電泳后陽性克隆得到337bp條帶，插入序列片段與DNA測序結(jié)果完全相符。重組慢病毒載體在293T細(xì)胞中包裝獲得滴度為2×108TU/ml的病毒顆粒，MOI=20，轉(zhuǎn)染效率為85%。轉(zhuǎn)染pFU-GV-BmS-1組、pFU-GV-BmS-2組及對照組BmS mRNA相對表達水平分別為：0.743±0.025、 0.466±0.023、 1.266±0.042(組間兩兩比較，Plt;0.05)。結(jié)論BimS慢病毒RNA干擾載體構(gòu)建成功，并能高效感染ACC-2細(xì)胞及下調(diào)BmS mRNA表達。

RNA干擾；BimS基因； 慢病毒表達載體

癌癥的發(fā)生、發(fā)展與凋亡相關(guān)基因的調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡作用有關(guān)[1-2]。Bim(Bcl-2 inferacting mediator of cell death)是BH3-only蛋白家族中促凋亡成員及線粒體凋亡途徑主要凋亡蛋白[3]，Bim前體mRNA選擇性剪接形成編碼蛋白分別為110、140和196個氨基酸，及相對分子質(zhì)量15、19、23(×103)的3 種異構(gòu)體，即BimS、BimL和BimEL。研究表明3 個異構(gòu)體中BimS促凋亡活性最高[4]，基于Bim蛋白在藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用，本研究采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建BimS慢病毒RNA干擾載體，擬轉(zhuǎn)染腺樣囊性癌細(xì)胞下調(diào)BimS mRNA及蛋白表達，旨在研究促凋亡蛋白Bim的表達活化對不同化療藥物誘導(dǎo)的腺樣囊性癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響及分子機制，探討其成為化療藥物治療的作用靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑： Age I， EcoR I， T4DNAligase(Promega)；質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Omga)；GV248慢病毒載體(吉凱基因公司)；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞(由本院中心實驗室提供)；polybrene感染添加劑， Eni.S溶液， pHelper 1.0、pHelper 2.0(吉凱公司)； RPMI-1640， 小牛血清(Gibco)。 主要儀器：低溫高速離心機， 臺式離心機(Sigma)；恒溫培養(yǎng)箱， 恒溫?fù)u床(Thermo)；熒光倒置顯微鏡(Nikon)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA靶序列設(shè)計 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人BimS序列，選取2 個長度為19 bp的特異性寡核苷酸作為靶序列，編號為RNAi-33906(TGATGTAAGTTCTGAGTGT)； RNAi-33907(CCCTACAGACAGAGCCACA)；陰性干擾序列：RNAi-NC(TTCTCCGAACGTGTCACGT)。

1.2.2 病毒載體構(gòu)建框架 以特異性寡核苷酸序列作為模板，按堿基互補配對原理，在兩互補鏈之間設(shè)CTCGAG為Loop區(qū)，后接TTTTTTG轉(zhuǎn)錄終止信號，5′端引入Age I酶切位點， 3′端引入EcoR I酶切位點，按每個靶序列設(shè)計合成正反2 條鏈組成特異性寡核苷酸鏈。 編號：RNAi-33906-a: 5′-CCAATCTGATGTAAGTTCTGAGTGTCTCGAGACACTCAGAACTTACATCAGA T

TTTTg-3′； RNAi-33906-b:5′-AATTCAAAAATC TGATGTAAGTTCTGAGTGTCTCGAGA CACTCAGAACTTACA

TCAGA-3′，RNAi-33907-a：CCAACT CCCTACAGACAG

AGCCACACTCG AGTGTGGCTCTGTCTGTAGGGAG TT

TTTg-3′； RNAi-33907-b：AATT CAAAAACTCCCTACA GACAGAGCCACACTCGAGTGTGGCTCTGTCTGTAGGG

AG-3′。陰性序列：GV112-NC-15′-CCG GTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCG

GAGAATTTTTG-3′GV112-NC-25′-AATTCAAAAATTC

TCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTT

CGGAGAA-3′。

1.2.3 DNA片段合成及連接入載體 將oligo用oligo annealing buffer溶解成20 μmol/L互補單鏈，各取30 μl混合，置95 ℃水浴中加熱15 min，取出自然冷卻至室溫形成雙鏈oligo片段，取1 μl用于后續(xù)的連接反應(yīng)。 用Age I和EcoR I雙酶切GV112質(zhì)粒載體回收7.4 kb片段。將退火的雙鏈oligo與線性化載體連接，連接反應(yīng)體系設(shè)陽性對照組，自鏈組和連接組。

1.2.4 重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化 用冷卻的無菌吸頭從感受態(tài)細(xì)胞懸液中取200 μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加2 μl連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30 min，將EP管放置欲加溫到42 ℃水浴中熱激90 s，迅速轉(zhuǎn)入到冰浴中冷卻2 min。 加800 μl SOC液體培養(yǎng)基，置37 ℃搖床溫育45 min使細(xì)菌復(fù)蘇。將150 μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到20 mmol/L MgSO4和Amp抗性(100 μg/ml)的LB固體瓊脂平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱16 h。

1.2.5 陽性克隆鑒定 挑取平板上生長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10 μl LB培養(yǎng)液中，從中取1 μl做模板進行菌落PCR鑒定。PCR引物為primer(+)：5′-CCTATT-TCCCATGATTCCTTCATA-3′；primer(-)：5′-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3′。 10×buffer 2 μl; dNTPs(2.5 mmol/L)0.8 μl; primer(+)0.4 μl; primer(-)0.4 μl;Taq polymerase 0.2 μl; Template 1 μl; dd H2O補至20 μl。 94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30 cycle,72 ℃ 6 min。

1.2.6 重組載體測序鑒定 將構(gòu)建的重組載體陽性克隆保種并分裝100 μl送北京華大基因公司進行DNA測序分析。

1.2.7 重組慢病毒包裝及滴度檢測 分別提取pFU-GV-RNAi、pHelper 1.0、 pHelper 2.0 3 種質(zhì)粒，按Lipofectamin-2000說明書進行轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

1.2.8 ACC-2細(xì)胞感染預(yù)實驗 實驗前1 d，以每毫升3×104個目的細(xì)胞接種96 孔培養(yǎng)板，體積90 μl， 細(xì)胞融合至50%，實驗分為4 組，每組4 個不同梯度MOI。配制1×108TU/ml， 2×107TU/ml， 1×107TU/ml， 1×106TU/ml病毒液。取5 μl病毒液稀釋到45 μl的Eni.S中，再進行1 次10 倍稀釋即可。 取2 μl 10 mg/ml polybrene 稀釋到400 μl備用。將10 μl 4 個不同梯度的病毒加到各組的相應(yīng)孔中。(加入的病毒量分別為1×106TU， 2×105TU， 1×105TU， 1×104TU，細(xì)胞數(shù)為1×104個， MOI分別為100、 20、 10、 1)，在polybrene孔中加10 μl polybrene稀釋液(終濃度為5 μg/ml)，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)， 8～12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換新鮮培養(yǎng)基。感染3～4 d后觀察熒光表達情況。

1.2.9 BimS mRNA PCR檢測 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞提取RNA反轉(zhuǎn)錄 cDNA，BimS上游引物5′-GCAATGGTAGTCATCCTAGAGG-3′；下游引物5′-ATCCTTGTGGTTGAGTTGTTCT-3′；GAPDH上游引物 5′- TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物5′- CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3，(上海生工合成)。SYBR premix extaq 10.0 μl,上游引物(2.5 μmol/L)0.5 μl, 下游引物(2.5 μmol/L)0.5μl,cDNA 1.0 μl, RNase-free H2O 8.0 μl。 95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 45 cycle； 95 ℃15 s， 55 ℃ 30 s， 95 ℃ 15 s， 1 cycle。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物鑒定

連接入vshRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為508 bp條帶，空載體克隆PCR片段大小為543 bp條帶，表明目的片段已插入載體中(圖 1～2)。

2.2 陽性克隆測序分析

測序結(jié)果中顯示有與設(shè)計相同的靶序列，表明BimS慢病毒表達載體構(gòu)建成功，并命名編號33906為pFU-GV-BimS-1；編號33907為pFU-GV-BimS-2；陰性干擾序列為pFU-GV-RNAi NC(圖 3～4)。

1: 陰性對照; 2: 自連對照; 3: Marker(5、 3、 2、 1.5、 1 kb、 750、 500、 250、 100 bp); 4～8: 挑取的轉(zhuǎn)化子

圖 1 RNAi-33906菌落PCR擴增電泳鑒定

1: Negative control; 2: Self even control; 3: Marker(5, 3, 2, 1.5, 1 kb, 750, 500, 250, 100 bp); 4-8: Selected transformants

Fig 1 PCR amplification electrophoresis identification map of RNAi-33906 colony

1: 陰性對照; 2: 自連對照; 3: Marker(5、3、2、1.5、1 kb、750、500、250、100 bp); 4～8: 挑取的轉(zhuǎn)化子

圖 2 RNAi-33907菌落PCR擴增電泳鑒定圖

1: Negative control; 2: Self even control; 3: Marker(5, 3, 2, 1.5, 1 kb, 750, 500, 250, 100 bp) ; 4-8: Selected transformants

Fig 2 PCR amplification electrophoresis identification map of RNAi-33907 colony

圖 3 RNAi-33906-a測序圖 圖 4 RNAi-33907-a測序圖

Fig 3 Sequencing graph of RNAi-33906-a Fig 4 Sequencing graph of RNAi-33907-a

2.3 重組慢病毒滴度及熒光照片

重組慢病毒感染293T細(xì)胞96 h后觀察熒光表達，數(shù)出最后2 孔中熒光細(xì)胞數(shù)，將得到的熒光細(xì)胞數(shù)除以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，得到病毒原液的滴度值。結(jié)果獲得重組慢病毒顆粒滴度為2×108TU/ml(圖 5)。

2.4 重組慢病毒感染效率

重組慢病毒感染ACC-2細(xì)胞在感染增強溶液Eni.S和5 μg/ml polybrene感染添加劑條件下易被感染， MOI為20時可以達到80%以上的感染效率。結(jié)果表明重組慢病毒能有效感染ACC-2細(xì)胞(圖 6)。

2.5 BmS mRNA表達

采用定量RT-PCR檢測BimS mRNA，以2-ΔΔct法計算基因相對表達量，轉(zhuǎn)染pFU-GV-BmS-1組、pFU-GV-BmS-2組和對照組BmS mRNA相對表達水平分別為： 0.743±0.025、 0.466±0.023、 1.266±0.042。

A：10-1； B： 10-2； C: 10-3； D: 10-4； E: 10-5； F: 10-6； G: 10-7； H: 10-8

圖 5 2×108TU/ml病毒(GFP)滴度檢測圖片

Fig 5 Detection picture of 2×108TU/ml virus (GFP) titer

A: Fluorescence-field(GFP); B: Bright-field

Fig 6 The infection efficiency of the recombinant lentivirus into ACC-2 cells(MOI=20)

pFU-GV-BmS-1組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)； pFU-GV-BmS-2組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)； 2 個干擾組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。

3 討 論

RNA干擾(RNA interference,RNAi)，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)，由Fire等[3-4]1998 年首次向秀麗線蟲注射雙鏈RNA時發(fā)現(xiàn)。是將特異性同源雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使目的基因不表達或表達水平下降。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性敲除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于探索基因功能及腫瘤的基因治療領(lǐng)域[5-6]。

涎腺腺樣囊性癌(adenoid cvstic carcinoma,ACC)是口腔常見的涎腺惡性腫瘤之一,目前針對ACC主要采取外科手術(shù)為主，放療和化療為輔的治療方式。手術(shù)后常有局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其遠(yuǎn)期治療效果不佳。對于晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者，化療仍然是一種重要的治療手段，但目前臨床上應(yīng)用的常規(guī)化療藥物效果并不理想。因此，開發(fā)新的化療藥物、探索新的化療藥物作用靶點、提高腫瘤對化療藥物的敏感性、增加化療藥物的療效，是腺樣囊性癌治療的重要研究方向。

研究認(rèn)為Bcl-2家族分子在藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過程中起著決定性的作用, Bim可促進腫瘤細(xì)胞的死亡,很多化療藥物通過調(diào)節(jié)Bim表達來發(fā)揮殺滅腫瘤細(xì)胞的功能[7-8]。Bcl-2家族包括3 個亞家族：抗凋亡的Bcl-2亞家族，如Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1等；促凋亡的Bax亞家族，如Bax、Bak；僅具有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡亞家族，如Bid、 Bim、 Bad、 Bik、 PUMA等，這些蛋白多定位于線粒體膜上，在線粒體凋亡途徑中起著重要作用。據(jù)報道人類Bim基因定位的染色體區(qū)域位于很多腫瘤的染色體區(qū)域內(nèi)，Bim 基因的缺失可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生，并和一些化療藥物的敏感性有關(guān)[9-11]。Bouillet等[12]實驗表明，紫杉醇作用于腎上皮癌細(xì)胞時，缺失Bim則產(chǎn)生凋亡抵抗。不同的細(xì)胞類型Bim的功能和調(diào)節(jié)方式各異，下調(diào)Bim基因及蛋白表達有助于深入探討其促凋亡的分子機制及對化療藥物的抵抗作用。目前在涎腺腺樣囊性癌基因治療研究中還沒有針對沉默BimS基因的報道。因此，本課題根據(jù)BimS序列選取2 個長度為19 bp的特異性寡核苷酸作為靶序列構(gòu)建慢病毒RNA干擾載體，通過PCR擴增和DNA測序鑒定證明測序結(jié)果中顯示有與設(shè)計相同的靶序列，表明BimS慢病毒表達載體構(gòu)建成功，并命名為pFU-GV-BimS-1, pFU-GV-BimS-2, 陰性干擾序列為pFU-GV-RNAi NC。

目前，常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，腺病毒一般不能整合到染色體上只能瞬時轉(zhuǎn)染，與其相比慢病毒具有可以感染非分裂期細(xì)胞且容納外源基因片段， 可進行長期表達等優(yōu)點，采用第3 代慢病毒載體不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有較高的安全性。本實驗重組慢病毒載體在293T細(xì)胞中包裝，獲得滴度為2×108TU/ml的病毒顆粒，Eni.S溶液是一種感染增強溶液，polybrene感染添加劑能提高病毒的感染效率，在重組慢病毒感染ACC-2細(xì)胞時應(yīng)用Eni.S和5 μg/ml polybrene條件下易被感染， MOI為20時可以達到80%以上的感染效率。實驗表明重組慢病毒能有效感染ACC-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pFU-GV-BmS-1組、pFU-GV-BmS-2組和對照組， BmS mRNA相對表達水平分別為0.743±0.025、 0.466±0.023、 1.266±0.042。 pFU-GV-BmS-1組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；pFU-GV-BmS-2組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)； 2 個干擾組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)果顯示，構(gòu)建的2 個RNA干擾載體均能下調(diào)BmS mRNA表達，pFU-GV-BmS-2的干擾作用強于pFU-GV-BmS-1。為下一步的實驗研究打下了良好基礎(chǔ)。

[1] 曲貝貝, 左金華, 朱玉紅, 等. Survivin和PDCD5在黏液表皮樣癌組織中的表達及臨床意義[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 32(2): 225-229.

[2] 岳增文, 曹選平, 劉進忠, 等. 口腔鱗癌中LATS2基因mRNA與蛋白表達及其相關(guān)性[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 32(3): 432-433.

[3] Sunters A, Madureira PA, Pomeranz KM, et al. Paclitaxel-induced nuclear translocation of FOXO3a in breast Cancer cells is mediated by c-Jun NH2-terninal kinase and Akt[J]. Cancer Res, 2006, 66(1):212-220.

[4] Marani M, Tenev T, Hancock D, et al.Identification of novel isoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis[J]. Mol Cell Biol, 2002, 22(11):3577-3589.

[5] Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 1998, 391(6669):806-811.

[6] Hammond SM, Bernstein E, Beach D, et al. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J]. Nature, 2000, 404(6775):293-296.

[7] Hemann MT, Fridman JS, Zilfou JT, et al. An epi-allelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypesinvivo[J]. Nat Genet, 2003, 33(3):396-400.

[8] Jiang M, Milner J. Bcl-2 constitutively suppresses p53-dependent apoptosis in colorectal cancer cells[J]. Genes Dev, 2003, 17(7):832-837.

[9] Wang J, Zhou JY, Wu GS. Bim protein degradation contributes to cisplatin resistance[J]. J Biol Chem, 2011, 286(25):22384-22392.

[10]Yan HJ, Liu WS, Sun WH, et al. miR-17-5p inhibitor enhances chemosensitivity to gemcitabine via upregulating Bim expression in pancreatic cancer cells[J]. Dig Dis Sci, 2012, 57(12):3160-3167.

[11]張芳, 李洋, 吳蘅, 等. MiR-192靶向負(fù)調(diào)控Bim表達誘導(dǎo)肺癌順鉑耐藥[J]. 中國肺癌雜志, 2014, 17(5):384-390.

[12]Bouillet P, Metcalf D, Huang DC, et al. Proapoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses, leukocyte homeostasis, and to preclude autoimmunity[J]. Science, 1999, 286(5445):1735-1738.

(收稿： 2016-10-06 修回： 2016-12-04)

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ConstructionandtheinfectionefficiencyofBimSlentivirusRNAinterferencevector

YAOJia,RAOGuozhou,LIXukui.

710004,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,StomalogicalHospitalofMedicalCollege;Xi'anJiaotongUniversity,China

Objective: To construct BimS lentivirus RNA interference(RNAi) vector and to study its infection efficiency by using RNAi technique.MethodsThree interference targets were designed according to the BimS sequence. The single chain primer was annealed into double-stranded oligo sequences, and then connected with vector linearized with Age I and EcoR I enzyme. The recombinant plasmid was packaged, and the infection efficiency was observed by infecting ACC-2 cells.ResultsAfter amplification, a 337 bp band was appeared in the electrophoresis results of positive clones. Sequence of inserted fragments were identical with the result of DNA sequencing. Restructuring lentivirus was packed in 293T cells, the virus titer was 2×108TU/ml, MOI=20, and the transfection efficiency was 85%. The BmS mRNA relative expression of pFU-GV-BmS-1, pFU-GV-BMS-2 and control group was 0.743±0.025， 0.466±0.023 and 1.266±0.042 respectively(between each 2 groups,Plt;0.05).ConclusionBimS lentivirus virus RNA interference vectors can be constructed, and can efficiently infect ACC- 2 cells.

RNAinterference;BimSgene;Lentivirusvector

陜西省社發(fā)攻關(guān)資助項目(編號： 2013k12-03-21)

710004， 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科

李旭奎 E-mail: lixukui@mail.xjtu.edu.cn

Q786

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.008