宋夢陽 王方圓 侯晉 殷學(xué)民

SACC-83來源的外泌體調(diào)節(jié)唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)FAP的實(shí)驗(yàn)研究

宋夢陽 王方圓 侯晉 殷學(xué)民

目的研究腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)細(xì)胞SACC-83來源的外泌體(exosome，EXO)對人正常唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞(human normal salivary gland stromal fibroblasts，hSGSFs)表達(dá)成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)的影響。方法采用超濾管濃縮與EXO提取試劑盒相結(jié)合的方法從SACC-83的培養(yǎng)上清中提取EXO，通過透射電鏡及Western Blot對所提取的EXO進(jìn)行鑒定；將SACC-83來源的EXO用熒光染料PKH67標(biāo)記后與hSGSFs共培養(yǎng)48 h，采用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察hSGSFs對于SACC-83來源的EXO的攝取情況；利用qRT-PCR和Western Blot法檢測在SACC-83來源的EXO作用下，hSGSFs中FAP的表達(dá)變化。結(jié)果SACC-83培養(yǎng)上清中所提取到的微囊泡直徑為30～100 nm，EXO的膜蛋白標(biāo)記物CD63和TSG101的表達(dá)為陽性；攜帶PKH67熒光標(biāo)記的EXO可被hSGSFs攝取，并可在mRNA和蛋白水平上調(diào)hSGSFs中FAP的表達(dá)。結(jié)論SACC-83來源的EXO可被hSGSFs攝取，并可顯著上調(diào)hSGSFs中FAP的表達(dá)。提示ACC可能通過EXO途徑促進(jìn)正常唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞向癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)的轉(zhuǎn)化。

腺樣囊性癌； 外泌體； 成纖維細(xì)胞活化蛋白； 癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞

外泌體(exosome，EXO)是指由細(xì)胞內(nèi)多泡小體(MVBs)與細(xì)胞質(zhì)膜融合并把其內(nèi)含小泡分泌至細(xì)胞外的一類膜性生物小囊泡[1]。研究證實(shí)，EXO廣泛存在于血液、唾液、尿液、乳汁以及羊水等多種體液中，而且所有體外培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中都含有EXO[2]。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體(tumor exosomes, TEX)是指來源于腫瘤細(xì)胞并向外分泌至腫瘤微環(huán)境中的外泌體，由于其包裹著腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的特異性腫瘤調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)、mRNA 和ncRNA，并可將這些活性物質(zhì)靶向性傳遞給間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及免疫細(xì)胞，通過影響受體細(xì)胞基因表型改變蛋白功能，達(dá)到促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及免疫抑制的目的；或在局部及遠(yuǎn)處形成一個(gè)“腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境”(pre-metastatic niche)，以利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。TEX與正常細(xì)胞來源的EXO相比具有其特殊性，即它可以“馴化”腫瘤微環(huán)境細(xì)胞，使其獲得惡性腫瘤的間質(zhì)細(xì)胞特征，甚至可以將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞[3]。

腫瘤微環(huán)境中包含間質(zhì)成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及血管等成分，其中癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast, CAF)已被證實(shí)在腫瘤發(fā)展的各階段具有顯著的作用[4]。細(xì)胞表面抗原成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)作為CAF的重要標(biāo)記物，研究證實(shí)FAP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有促進(jìn)腫瘤血管生成及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解等作用，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[5]。本文探討腺樣囊性癌細(xì)胞株SACC-83來源的TEX對正常人唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞(human salivary gland stromal fibroblasts, hSGSFs)中FAP表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究ACC來源的TEX在ACC侵襲和轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Corning，美國)；角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(KGM-Gold Keratinocyte Growth Medium) (Lonza， 美國)；青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg /ml、胰蛋白酶(Gibco，美國)；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)；熒光定量PCR試劑盒(Roche，瑞士)；兔抗人CD63單克隆抗體、兔抗人TSG101單克隆抗體、兔抗人FAP多克隆抗體(Abcam，英國)；100 kDa 超濾管(Millipore，美國)；Total Exosome Isolation Reagent(Invitrogen，美國)；Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher，美國)；PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit(Sigma，美國)；Alexa Fluor?594 Phalloidin(molecular probe，美國)；共聚焦培養(yǎng)皿(NEST)；FV10i 激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)；65670 貝克曼高速離心機(jī)(Beckman，美國)；羅氏L480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；Odyssey近紅外成像系統(tǒng)(Licor，德國)。

1.2 人唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定、SACC-83的傳代培養(yǎng)

用于hSGSFs的原代培養(yǎng)的樣本取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔頜面外科住院患者因舌下腺囊腫需要摘除的舌下腺間質(zhì)組織。術(shù)前患者未接受過任何治療，采用組織塊法培養(yǎng)hSGSFs,待細(xì)胞生長匯合達(dá)70%～80%時(shí)，進(jìn)行傳代、鑒定，取生長良好的第4代hSGSFs，使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法對其進(jìn)行鑒定。

復(fù)蘇后的SACC-83細(xì)胞(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院李勁松教授饋贈(zèng))用含10%FBS的RPIM 1640培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，用無菌PBS洗滌細(xì)胞3 遍，更換為無血清的KGM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，每72 h換液，收集培養(yǎng)上清用于TEX的提取。

1.3 腺樣囊性癌細(xì)胞SACC-83來源的EXO的提取及透射電鏡觀察

將收集的SACC-83細(xì)胞培養(yǎng)上清液在4 ℃下以300 g力離心5 min，去除死亡細(xì)胞，再行2 000 g力離心20 min，10 000 g力離心30 min，以去除其他MVBs；將離心后的上清液用100 kDa的超濾管濃縮，在得到的上清濃縮液中，以2∶1比例加入Total Exosome Isolation Reagent(Invitrogen，美國)，4 ℃過夜，10 000 g力離心60 min，將所得沉淀用PBS重懸，使用Micro BCA Protein Assay Kit進(jìn)行定量。所得到的外泌體用2%磷鎢酸負(fù)染后，滴于銅網(wǎng)上，透射電鏡下觀察(120 kV)。

1.4 hSGSFs 對SACC-83來源的EXO的攝取實(shí)驗(yàn)

使用PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit，按說明書對SACC-83來源的TEX進(jìn)行標(biāo)記。將hSGSFs以104/ml密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，加入2 μg PKH67標(biāo)記的TEX。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS清洗2 次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌2～3 次，每次10 min,1%Triton 透化處理10 min；然后PBS洗滌2～3 次，每次10 min；加入1 ml 1%BSA，孵育20～30 min;滴加適宜濃度的Alexa Fluor?594 Phalloidin和DAPI對細(xì)胞骨架中的F-actin和細(xì)胞核進(jìn)行染色；共聚焦顯微鏡下觀察hSGSFs對SACC-83來源的TEX的攝取情況。

1.5 qRT-PCR

將2 μg SACC-83來源的TEX與hSGSFs共培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞用RNAiso Plus裂解，按照產(chǎn)品說明提取總RNA。以總RNA為模板，使用PrimerScript RT Reagent Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR檢測FAP基因在對照組與TEX處理組的hSGSFs中的表達(dá)。所用引物序列見表 1。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min(預(yù)變性)；95 ℃ 10 s(變性)；60 ℃ 20 s(退火)；72 ℃ 20 s(延伸)；變性、退火、延伸共45 個(gè)循環(huán)。

表 1 FAP及GAPDH引物序列及大小

1.6 Western Blot

將提取的SACC-83來源的EXO或收集的細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA法定量，每個(gè)樣本以40 μg的總蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE電泳,Odyssey近紅外成像系統(tǒng)掃描成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

qRT-pCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行處理。用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，采用雙側(cè)性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 TEX的鑒定

透射電鏡下，可以觀察到從SACC-83培養(yǎng)上清中提取的微囊泡直徑在30～100 nm之間(圖 1)，符合文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體的直徑范圍。Western Blot結(jié)果顯示，該微囊泡表達(dá)外泌體特異性蛋白CD63和TSG101(圖 2)，證實(shí)所提取的微囊泡為外泌體。

圖 1 透射電鏡下觀察來源于腺樣囊性癌細(xì)胞SACC-83的外泌體

Fig 1 Exosomes derived from SACC-83 cells oberved under TEM

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定hSGSFs

對細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色觀察,顯示細(xì)胞角蛋白CK19染色陰性, 而波形絲蛋白染色強(qiáng)陽性，胞質(zhì)內(nèi)陽性顆粒均勻分布,胞核清晰、無染色；證明培養(yǎng)的細(xì)胞為中胚層來源,且無上皮源性細(xì)胞混雜(圖 3)。結(jié)合取材部位可證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為hSGSGs。

圖 2 Western blot鑒定外泌體特異性蛋白CD63、TSG101

Fig 2 Western blot analysis of exosomal markers CD63 and TSG101

圖 3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的hSGSFs

(A: CK19表達(dá), B: Vimentin表達(dá); ×200)

Fig 3 Primarily cultured normal human SGSFs examined by IHC

(A: CK19 expression, B: Vimentin expression; ×200)

2.3 hSGFSs對于SACC-83來源的TEX的攝取

SACC-83來源的TEX作用hSGSFs 72 h后，激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到：被PKH67標(biāo)記的、呈現(xiàn)綠色熒光的TEX主要位于hSGFs的胞質(zhì)內(nèi)，且主要分布在核周；而且?guī)缀跛械募?xì)胞內(nèi)都可觀察到綠色熒光。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，正常唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞可攝取SACC-83來源的TEX(圖 4)，也就是說，hSGSFs 是SACC-83來源的TEX的靶細(xì)胞。腺樣囊性癌細(xì)胞可能通過外泌體途徑改變正常唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)。

圖 4 共聚焦顯微鏡下觀察共培養(yǎng)48 h后hSGSFs對SACC-83來源的TEX的攝取 (×60)

Fig 4 Confocal microscopy observation of PKH67-labeled (green) SACC-83 TEX uptake by hSGSFs after co-culture for 48 h (×60)

2.4 腺樣囊性癌來源TEX對于hSGSFs中FAP表達(dá)的影響

SACC-83來源的TEX作用hSGSFs 72 h后，qRT-PCR的結(jié)果顯示：TEX處理組hSGSFs中FAP的表達(dá)水平明顯高于對照組(P=0.006 7)(圖 5)。我們應(yīng)用Western Blot對該結(jié)果進(jìn)行了蛋白水平的驗(yàn)證。Western Blot的結(jié)果顯示，對照組的hSGSFs中FAP的表達(dá)為陰性，而在SACC-83來源的TEX作用后，hSGSFs中FAP的表達(dá)則呈陽性(圖 5)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在SACC-83來源的TEX作用下，hSGSFs可能具備了向腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢；同樣表明了ACC可以通過EXO途徑改變間質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)功能。

圖 5 SACC-83細(xì)胞來源的TEX誘導(dǎo)hSGSFs中FAP的表達(dá)

Fig 5 Quantitative real time PCR and Western blot analysis of FAP mRNA and protein expression in hSGSFs after co-culture with TEX derived from SACC-83 cells

3 討 論

腫瘤細(xì)胞來源的EXO作為腫瘤“信息”的攜帶者，通過供受體之間的交換作用將其內(nèi)含的mRNA、miRNA、DNA等遺傳物質(zhì)靶向輸送至腫瘤局部或遠(yuǎn)處的微環(huán)境受體細(xì)胞中，從而調(diào)節(jié)部分腫瘤相關(guān)因子的表達(dá)或促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等促瘤機(jī)制的激活，以達(dá)到促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移作用[6]。Clayton[7]研究組發(fā)現(xiàn)，來源于間皮癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及乳腺癌細(xì)胞的TEX皆能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有CAF特性的成肌纖維細(xì)胞。Paggetti等[8]發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞來源的EXO可以促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移以及炎性細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化成腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。這些研究都表明，TEX可以作用于正常細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成。

經(jīng)研究證實(shí)，F(xiàn)AP作為腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞(cance-associated fibroblast,CAF) 的表面特異性抗原，在一系列的促瘤過程中具有重要作用[9]。Goodman等[10]發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435/436中有高水平的FAP表達(dá)，提示FAP具有促進(jìn)腫瘤生長的能力。Lai等[11]研究發(fā)現(xiàn)使用siRNA沉默F(xiàn)AP基因可以抑制腫瘤的生長，并導(dǎo)致體外CAF細(xì)胞周期的停止，達(dá)到抑瘤的效果。以上結(jié)果均證實(shí)了FAP作為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞CAF的特異性抗原，可使其母細(xì)胞獲得惡性腫瘤的生物學(xué)特征，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

為了明確SACC-83來源的TEX是否能夠靶向hSGSFs并促進(jìn)其向CAF轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)首先將PKH67綠色熒光標(biāo)記的TEX與hSGSFs共培養(yǎng)，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)hSGSFs可以攝取SACC-83來源的TEX，表明了hSGSFs為SACC-83來源的TEX的靶細(xì)胞，這也意味著腺樣囊性癌細(xì)胞可通過EXO途徑將促瘤因子靶向傳遞給hSGSFs，以改變其基因表型，影響其生物學(xué)功能。隨后本研究通過qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，經(jīng)SACC-83來源的TEX作用后，hSGSFs內(nèi)FAP的表達(dá)量顯著增高，提示SACC-83來源的TEX具有誘導(dǎo)hSGSFs向CAF轉(zhuǎn)化的能力，通過增加促瘤基因FAP的表達(dá)來調(diào)控腫瘤微環(huán)境中hSGSFs惡性化、致瘤化從而大大提高腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。但是TEX使hSGSFs內(nèi)FAP含量增加的具體機(jī)制尚不明了，是通過miRNA基因調(diào)控亦或是其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控尚未可知，有待于進(jìn)一步的深入研究。

本研究的結(jié)果顯示，SACC-83來源的TEX可以被正常人唾液腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞所攝取，并可顯著上調(diào)hSGSFs細(xì)胞內(nèi)FAP的表達(dá)。該結(jié)果說明，SACC-83來源的TEX可以靶向hSGSFs，并改變其表型，促進(jìn)其向癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

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(收稿： 2016-06-02 修回： 2016-09-07)

SACC-83-derivedexosomesinducefibroblastactivationproteinexpressioninnormalsalivaryglandstromalfibroblasts

SONGMengyang,WANGFangyuan,HOUJin,YINXuemin.

510515Guangzhou,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,China

Objective: To study the effects of exosomes(EXO) released by adenoid cystic carcinoma SACC-83 cells on the expression of fibroblast activation protein (FAP) in normal human salivary gland stromal fibroblasts (hSGSFs).MethodsACC exosomes were isolated from SACC-83 cell culture supernatant by using Total Exosome Isolation Reagent. The whole-mount EXO were characterized and assessed by transmission electron microscope and Western Blot. The exosomes were labeled with green fluorescent dye PKH67 and co-cultured with hSGSFs for 48h, followed by staining with Alexa Fluor 594 Phalloidin and DAPI. Afterwards, exsosomes uptake was observed under a laser scanning confocal microscope. After a 48-hour co-culture of SACC-83 exosomes with hSGSFs, the expression of FAP in SACC-83-EXO-treated hSGSFs was investigated by qRT-PCR and Western Blot.ResultsThe vesicles isolated from SACC-83 cell culture supernatant had the reported size range of 30-100 nm, expressed the exosomal marker CD63 and TSG101. After co-culture of hSGSFs with PKH67 labeled SACC-83 exosomes, exosomes were taken up by hSGSFs and FAP expression was elevated in hSGSFs.ConclusionExosomes derived from SACC-83 cells can be taken up by hSGSFs and can induce the expression of FAP in hSGSFs. These results suggest that exosomes derived from SACC-83 cells might induce the transformation of normal salivary gland stromal fibroblasts to cancer associated fibroblasts.

Adenoidcysticcarcinoma;Exosomes;Fibroblastactivationprotein;Cancer-associatedfibroblasts

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)： 2014A020212397)

510515 廣州， 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔頜面外科，南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

殷學(xué)民 E-mail: yinxm@fimmu.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.015