崔碩 王鵬 高秀秋

Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的藥物性牙齦增生中的表達

崔碩 王鵬 高秀秋

目的探討Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的藥物性增生的牙齦組織中的表達。方法選擇正常牙齦對照組、(未服藥)高血壓牙齦增生組、硝苯地平引起的藥物性牙齦增生組各10 例，用Western-Blot和RT-PCR檢測牙齦組織中Wnt1、β-catenin的表達。結果藥物性牙齦增生組的牙齦組織中Wnt1、β-catenin蛋白及mRNA表達水平顯著高于正常牙齦對照組(Plt;0.05)和高血壓牙齦增生組(Plt;0.05)。結論硝苯地平引起的藥物性牙齦增生的牙齦組織中Wnt1、β-catenin表達水平增高，可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進牙齦成纖維細胞的增殖導致牙齦纖維化。

藥物性牙齦增生(DGO)； Wnt1； β-catenin； Wnt/β-catenin信號通路

藥物性牙齦增生(drug-induced gingival overgrowth，DGO)是由于長期服用某些藥物引起的牙齦增生性疾病，它的主要特征是牙齦的纖維性增生和體積增大。引起牙齦增生的藥物主要包括鈣離子拮抗劑、抗癲癇藥以及免疫抑制劑[1]。有文獻認為牙齦增生與肺纖維化有著相似之處[2]。Wnt/β-catenin信號通路參與了肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展，它的激活能誘導成纖維細胞增殖,并活化轉變?yōu)榧〕衫w維細胞,促進細胞外基質大量沉積。Wnt1、β-catenin蛋白作為Wnt/β-catenin信號通路的主要蛋白，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[3]。因此我們推測Wnt/β-catenin信號通路對藥物性牙齦增生的發(fā)生也有一定的調控作用。硝苯地平引起的牙齦增生是目前臨床上較為常見的藥物性牙齦增生，因此本實驗以硝苯地平引起的藥物性牙齦增生為研究對象，研究其與Wnt信號通路的關系。本研究通過檢測藥物性牙齦增生患者牙齦組織中Wnt1、β-catenin的表達，初步探討Wnt/β-catenin信號通路對藥物性牙齦增生的調控作用。

1 資料與方法

1.1 試劑與設備

1.1.1 主要試劑 Trizol(TaKaRa)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa RNA PCRTM Kit Ver 3.0)；Wnt1、β-catenin、β-actin引物合成(大連寶生物工程有限公司)；β-catenin抗體(proteintech)；Wnt1抗體(Elabscience)；β-actin抗體(Elabscience)；超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒(Beyotime)等。

1.1.2 主要設備 超凈工作臺( YJ-875，蘇州星湖恒晟潔凈設備有限公司)；PCR儀( TC-412，TECHNE，英國)；低溫超速離心機( Z323K，HERMLE，德國)；轉膜儀(Trans-Blot SD)，凝膠成像分析系統(tǒng)[(Gel Doc XR+)BIO-RAD，美國]等。

1.2 病例的選擇

選擇2013-08～2014-05在錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院牙周病就診的因硝苯地平引起的牙齦增生患者10 例(藥物性牙齦增生組)；未服藥的高血壓牙齦增生患者10 例(高血壓牙齦增生)以及正常牙齦對照者10 例(正常牙齦對照組)。入選者已知研究目的，參加本研究的潛在危險和利益，并簽署知情同意書。

服用硝苯地平的牙齦增生組納入標準[4]：①有高血壓病史，服用硝苯地平時間大于半年；②伴有牙齦增生且上下頜前牙區(qū)嚴重；③排除糖尿病等其他全身性疾??；④未同時服用苯妥英鈉、環(huán)孢菌素A等其他引起牙齦增生的藥物；⑤近半年內未接受過牙周基礎治療；⑥入選前3個月及觀察期內無抗生素服用史；⑦知情同意并能夠按時復診。

排除標準：①行動不便不能接受復診者；②治療和觀察期間換用非鈣拮抗劑類降壓藥物者；③口服避孕藥者；由非鈣拮抗類藥物(如苯妥英鈉、環(huán)胞菌素-A)引起的牙齦增生者。

分組：正常牙齦對照組(A)：選10名于我院因美觀或修復原因，行冠延長術的患者。高血壓牙齦增生組(B)： 10例牙齦增生患者有高血壓，但是未服用任何降壓藥，病情穩(wěn)定。藥物性牙齦增生組(C)：10例因服用硝苯地平而引起的牙齦增生患者。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本的獲取和保存 局麻下在牙齒唇頰側牙齦近、遠中垂直切至牙周袋底或齦溝底，另在袋底或溝底行水平切口。獲得的牙齦標本在-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Western-Blot檢測牙齦組織中Wnt1、β-catenin在蛋白水平的表達 ①制備蛋白樣品放于-80 ℃保存；②利用Bradford試劑盒測定總蛋白含量；③將樣品調成相同濃度，加入buffer，沸水煮5 min；④聚丙烯酰胺凝膠電泳：每例標本20 μl上樣，電泳(電壓80 V、電流40 mA)；⑤轉膜：半干式電轉印，聚丙烯酰胺凝膠浸入Transfer buffer 30 min，PVDF膜于甲醇中浸透后浸入Transfer buffer 10 min，恒電壓21 V轉移23 min，TBS洗5 min；⑥封閉：用封閉液室溫振搖封閉1 h；⑦一抗孵育4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3 次/5 min；⑧二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3 次/5 min；⑨化學發(fā)光，顯影，定影，利用Gel-Pro Ananlyzer軟件進行圖像分析。

1.3.3 RT-PCR檢測牙齦組織中Wnt1、β-catenin在核酸水平的表達 ①用TRIzol提取牙齦樣本總RNA;②逆轉錄合成cDNA：反應條件42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min， 5 ℃ 5 min,1 個循環(huán)，-80 ℃保存；③引物設計合成(由大連寶生物公司設計合成)，β-actin為內參對照(表 1);④PCR擴增：PCR反應體系：(β-actin)10×Taq Buffer 5 μl，MgCl24 μl,dNTP 1 μl,引物 3 μl，cDNA模版 1 μl，Taq DNA 0.5 μl，超純水35.5 μl，總體系50 μl；(Wnt1、β-catenin)10×Taq Buffer 2 μl，dNTP 1 μl,引物 2 μl，cDNA模版 1 μl，Taq DNA 0.2 μl，超純水13.8 μl，總體系20 μl。PCR反應條件：(β-actin)95 ℃預變性5 min，95 ℃變形45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s,72 ℃ 10 min,35 個循環(huán)；(Wnt1)95 ℃預變性5 min，95 ℃變形45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s,72 ℃ 10 min,30 個循環(huán)；(β-catenin) 95 ℃預變性5 min，95 ℃變形45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s,72 ℃ 10 min,30 個循環(huán);⑤瓊脂糖凝膠電泳分析：取PCR產物10 μl，經1.5%(β-actin)、2%(Wnt1、β-catenin)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)儀內掃描，使用Quantity One 軟件分析結果，以β-actin RNA的吸光度值進行標準校正。

表 1 PCR引物序列及反應條件

1.4 數據處理

2 結 果

2.1 3 組牙齦組織中Wnt1、β-catenin蛋白的表達

藥物性牙齦增生組C(0.322±0.067)與正常牙齦組A(0.014±0.008)相比，Wnt1蛋白的表達顯著上升(Plt;0.05)；與高血壓牙齦增生組B(0.082±0.031)相比，Wnt1蛋白的表達顯著上升(Plt;0.05)；B組與A組相比，Wnt1蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)(圖 1)。

C組(0.209±0.099)與A組(0.063±0.014)相比，β-catenin蛋白的表達顯著上升(Plt;0.05)；C組與B組相比，β-catenin蛋白的表達顯著上升(Plt;0.05)；B組(0.098±0.022)與A組(0.063±0.014)相比，β-catenin蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。

圖 1 牙齦組織中Wnt1、β-catenin蛋白的表達

2.2 3 組牙齦組織中Wnt1、β-catenin mRNA的表達

藥物性牙齦增生組C(1.254±0.042)與正常牙齦組A(0.088±0.002)相比，Wnt1 mRNA的表達顯著上升(Plt;0.05)；與高血壓牙齦增生組B(0.757±0.029)相比，Wnt1 mRNA的表達顯著上升(Plt;0.05)；B組與A組相比，Wnt1 mRNA的表達顯著上升(Plt;0.05)(圖 2)。

圖 2 牙齦組織中Wnt1、β-catenin mRNA的表達

C組(1.545±0.087)與A組(0.386±0.027)相比，β-catenin mRNA的表達顯著上升(Plt;0.05)；與高血壓牙齦增生組B(0.547±0.028)相比，β-catenin mRNA的表達顯著上升(Plt;0.05)；B組與A組相比，β-catenin mRNA的表達顯著上升(Plt;0.05)。

3 討 論

藥物性牙齦增生是指服用某種藥物所引起的牙齦組織過度生長和牙齦體積的增大。牙齦增生常首先發(fā)生于前牙而后向其他牙位擴展[5]，并表現為纖維性增生。各類藥物引起的牙齦增生的發(fā)生率不同，根據不同文獻報道,硝苯地平引起牙齦增生的發(fā)生率為0.5%～83%[2.6-7]。牙齦增生會帶來不同程度的危害，過度增生的牙齦組織可干擾正常的口腔功能，如咀嚼、吞咽、發(fā)音等，增生的牙齦可以擠壓牙齒使其移位，損害發(fā)音并影響外形美觀[8]。硝苯地平是鈣通道阻滯藥，是治療心血管系統(tǒng)疾病的常用藥，其通過與Ca2+通道特異性受體結合，阻滯Ca2+內流，在細胞因子如IL-2、整合素等的共同作用下，引起牙齦成纖維細胞增殖和膠原代謝失衡[7]。硝苯地平引起的牙齦增生主要表現為上下頜前牙區(qū)較重，并僅發(fā)生于有牙區(qū)，病理變化主要表現為上皮棘層顯著增厚，釘突伸長達到結締組織深部，結締組織有致密的膠原纖維束、大量成纖維細胞和新生血管，間有多量無定形基質，炎癥細胞較少。

Wnt1基因由370 個氨基酸組成，相對分子質量介于42 000～48 000之間，信號肽為一條含27 個氨基酸的短肽。包括4 個潛在的N連糖基化位點，外加23 個半胱氨酸。23 個半胱氨酸中有12 個位于該分子最后70 個氨基酸之中，其中2 個對于潛在的N連糖基化位點有重要作用[9]。β-catenin是Wnt信號通路中有調控轉錄活性的關鍵成員，能在細胞核內與TCF結合從而激活靶基因的轉錄，β-catenin 基因定位于3p21，由16 個外顯子組成，其中外顯子3的第37、33、41、45位密碼子編碼區(qū)域構成β-catenin 蛋白的NH2末端[10]。Wnt/β-catenin信號通路作為Wnt經典通路與各類腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[11]。Wnt1、β-catenin被證實參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，如宮頸癌[8]、前列腺癌[12]、胃癌[13]、肝癌[14]等。有研究表明Wnt信號通路對骨髓基質干細胞向成牙本質細胞樣分化的過程中起到了一定的調控作用[15]。近年來發(fā)現Wnt/β-catenin信號通路在纖維化疾病中異?；钴S，提示該通路可能參與纖維化形成過程。Konigshoff等[16]把肺纖維化患者與移植供體肺比較發(fā)現Wnt1、β-catenin、Wnt7b、Wnt10b在肺纖維化患者中均顯著增加。宋萍[3]實驗報道肺纖維化模型鼠肺組織β-catenin蛋白及mRNA表達升高，Wnt1干預人胚成纖維細胞，細胞增殖呈劑量依賴方式。表明Wnt/β-catenin信號通路能促進成纖維細胞的增殖及分化，在形成纖維化疾病中起著重要作用。但是關于Wnt信號通路與藥物性牙齦增生的相關性研究卻鮮有報道。

Wnt/β-catenin信號通路調控干細胞的增殖分化，正常成熟細胞中無Wnt信號，細胞質內游離的β-catenin水平很低，當Wnt信號通路被激活時，β-catenin在細胞質內大量聚集，并轉位進入細胞核，啟動靶基因轉錄，最終導致細胞的增殖和轉移[17-18]。藥物性牙齦增生中成纖維細胞增殖、遷移、黏附，進而造成組織纖維化。多項研究表明在纖維化器官中Wnt/β-catenin通路蛋白表達增強，信號通路異?；钴S，阻斷該信號通路后，纖維化標志因子表達減少，膠原纖維沉積減少，抑制了纖維化進程[19-20]。有研究表明DKK1通過與LRP5/6結合,抑制Wnt誘導的β-catenin/TCF依賴性基因轉錄來阻斷Wnt/β-catenin信號通路的活化[21]。He等[19]在阻塞性腎損傷模型中發(fā)現腎小管上皮細胞中β-catenin表達顯著增多,經典wnt通路活化,LEF1和纖維連接蛋白表達增強,而運用DKK1后,β-catenin顯著減少且Wnt/β-catenin靶基因被抑制,同時,DKK1抑制了肌成纖維細胞的活化,纖維細胞特異蛋白-1(FSP-1)、膠原蛋白I及纖連蛋白表達下調,導致阻塞腎模型中膠原纖維總量下降。以上研究表明Wnt/β-catenin活化導致肌成纖維細胞活化，進一步導致組織纖維化，這與本研究中藥物性牙齦增生患者牙齦組織中Wnt1、β-catenin蛋白的高表達呈現一致性。

本研究用Western-Blot、RT-PCR分別檢測正常牙齦、未服藥高血壓牙齦增生患者牙齦、硝苯地平引起的藥物性牙齦增生患者牙齦中Wnt1、β-catenin蛋白及mRNA的表達，結果顯示藥物性牙齦增生組Wnt1、β-catenin明顯高于另外2 組，表明Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白Wnt1、β-catenin在硝苯地平引起的藥物性牙齦增生的發(fā)生中起到一定的調控作用。但是高血壓牙齦增生組與正常對照組相比Wnt1、β-catenin的蛋白及mRNA表達結果不一致，兩者之間蛋白表達是否有差異還需要進一步驗證，另外Wnt1、β-catenin調控藥物性牙齦增生的具體作用機制還有待進一步探討。硝苯地平引起的藥物性牙齦增生與Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達有一定相關性，通過Wnt/β-catenin信號通路抑制劑來干擾信號通路活化從而阻止纖維化進程可能為今后治療藥物性牙齦增生提供新的方向。

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(收稿： 2016-10-16)

ExpressionofWnt1andβ-catenininthegingivaltissurewithgingivalovergrowthinducedbynifedipine

CUIShuo,WANGPeng,GAOXiuqiu.

121000,TheSecondAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity，China

Objective： To study the expression of Wnt/β- catenin signaling pathway related proteins Wnt1 and β- catenin protein in gingival tissues of the patients with drug-induced gingival overgrowth(DGO) caused by nifedipine.MethodsWnt1 and β- catenin expression were tested with Western Blot and RT-PCR in gingival tissues of 10 cases of DGO induced by nifedipine, 10 cases of high blood pressure with gingival hyperplasia(without use of any medicine) and 10 cases of healthy control.ResultsIn the gingival tissues of DGO group the levels of Wnt1 and β- catenin protein and mRNA were significantly higher than those of the healthy control group(Plt;0.05) and the high blood pressure group(Plt;0.05).ConclusionThe levels of Wnt1 and β-catenin are increased in nifedipine induced gingival hyperplasia. The gingival hyperplasia may be caused by the promotion of gingival fibroblast proliferation through Wnt/β- catenin signaling pathway.

Drug-inducedgingivalhyperplasia(DGO);Wnt1;β-catenin;Wnt/β-cateninsignalingpathway

全民口腔研究生科研創(chuàng)新基金(編號： QM2014014)

121000， 錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院

高秀秋 E-mail: jzgaoxiuqiu1988@163.com

R781.4+1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.017