劉思妤，楊 悅，王 鷹，王麗娟，吳秀菊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)體系的建立及優(yōu)化

劉思妤，楊 悅，王 鷹，王麗娟，吳秀菊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

以北細(xì)辛(Asarumheterotropoides)幼嫩葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織為材料，初步建立懸浮培養(yǎng)體系，同時(shí)探討接種量、光照、培養(yǎng)液量、轉(zhuǎn)速、蔗糖濃度、激素配比等因素對(duì)細(xì)胞生物量的影響。結(jié)果表明，100 mL的1/2MS液體培養(yǎng)基中，2 g愈傷組織是最適接種量，蔗糖濃度為30 g·L-1，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，0.6 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA，全天光照培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)量最大。北細(xì)辛懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線大致為“S”型，懸浮細(xì)胞的最佳收獲周期為15 d。經(jīng)懸浮培養(yǎng)后可快速獲得細(xì)胞團(tuán)及多種形態(tài)的單細(xì)胞，可為北細(xì)辛懸浮細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)，并進(jìn)一步提升北細(xì)辛的應(yīng)用價(jià)值。

北細(xì)辛；愈傷組織；懸浮培養(yǎng)；細(xì)胞生物量；培養(yǎng)條件；大規(guī)模生產(chǎn)

北細(xì)辛(Asarumheterotropoides)為馬兜鈴科細(xì)辛屬的多年生草本植物，主要分布于東北地區(qū)，具有較高的藥用價(jià)值[1]。揮發(fā)油是北細(xì)辛的主要有效成分，其中甲基丁香酚、黃樟醚、細(xì)辛醚等多種成分均具有抗炎抗風(fēng)濕、抑制各種致炎劑引起的腫脹反應(yīng)及超強(qiáng)的清除自由基能力[2-3]，其中黃樟醚是其有毒成分，經(jīng)過(guò)毒理試驗(yàn)基本了解了其在農(nóng)業(yè)防治病蟲(chóng)害方面有一定作用，但還未完全深入研究；通常含量最多的甲基丁香酚還具有解熱鎮(zhèn)痛及明顯的麻醉與中樞抑制作用[4]。但是，由于北細(xì)辛野生資源驟減，人工栽培又存在繁殖系數(shù)低及生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，導(dǎo)致現(xiàn)有的北細(xì)辛原材料不能滿足市場(chǎng)需求[5]。而植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)因具有易于控制環(huán)境、不受地域限制并且可以大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn)，已成為解決植物種質(zhì)資源短缺問(wèn)題的有效途徑[6-7]，被廣泛應(yīng)用于天然活性成分的生產(chǎn)。目前已有苦瓜(Momordicacharantia)、石榴(Punicagranatum)、枇杷(Eriobotryajaponica)、長(zhǎng)葉點(diǎn)地梅(Androsacelongifolia)、狹葉柴胡(Bupleurumscorzonerifolium)等多種植物的懸浮培養(yǎng)研究[8-20]，但尚未見(jiàn)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的研究報(bào)道。

基于北細(xì)辛組織培養(yǎng)前期的愈傷組織誘導(dǎo)、增殖研究結(jié)果[5]，本研究以北細(xì)辛幼嫩葉柄誘導(dǎo)出的松散型愈傷組織為初始材料，探討接種量、轉(zhuǎn)速、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等條件對(duì)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的影響，從而初步建立北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)體系，為后續(xù)北細(xì)辛細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)生有效活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

植物材料北細(xì)辛取自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物園。由北細(xì)辛幼嫩葉柄誘導(dǎo)出愈傷組織，繼代培養(yǎng)時(shí)通過(guò)激素調(diào)控獲得適于溶液培養(yǎng)的、松散的愈傷組織作為本研究的初始材料。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的初步建立 取5 g愈傷組織，用鑷子夾碎后接種于裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-16-BA+0.9 mg·L-1NAA，蔗糖濃度為30 g·L-1，pH 5.8。具體培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r·min-1，全天光照24 h。每7 d繼代一次，繼代前先靜置30 min，更換2/3的培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)2～3次繼代可初步形成穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系。

1.2.2接種量對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 分別取1、2、3、4、5 g愈傷組織接種到含有100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，重復(fù)3次。

1.2.3光照時(shí)間對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取愈傷組織2 g(本研究確定的最適接種量)接種到含有100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，光照時(shí)間分別為全天光照、全天黑暗、12 h光照12 h黑暗，其他培養(yǎng)條件同上，重復(fù)3次。

1.2.4培養(yǎng)液量對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取愈傷組織2 g接種到含有70、100、130、160、190 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，全天光照(本研究篩選出的最適光照)，其他培養(yǎng)條件同上，重復(fù)3次。

1.2.5轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取愈傷組織2 g接種到含有100 mL(本研究篩選出的最適培養(yǎng)液量)培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為110、130、150、170、190 r·min-1，其他培養(yǎng)條件同上，重復(fù)3次。

1.2.6蔗糖濃度對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取愈傷組織2 g接種到含有100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1(本研究篩選出的最適轉(zhuǎn)速)，其他培養(yǎng)條件同上，重復(fù)3次。

1.2.7外源激素濃度對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取愈傷組織2 g接種到含有100 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，除外源激素濃度外，其他培養(yǎng)條件同上。6-BA和NAA協(xié)同使用，進(jìn)行二因素三水平的正交試驗(yàn)，各重復(fù)3次。

1.2.8懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 在優(yōu)化的最適條件下，每瓶接種2 g，共培養(yǎng)25 d，每隔5 d取樣稱(chēng)重，每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，鮮重為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.9懸浮細(xì)胞形態(tài)的觀察 于培養(yǎng)的不同時(shí)期，用移液槍吸取培養(yǎng)物置于載玻片上，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞分散度。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，以GraphPad Prism軟件完成數(shù)據(jù)制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)體系的建立

2.1.1接種量對(duì)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的影響 起始接種密度對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定影響，過(guò)大或過(guò)小的接種量都不利于懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)接種量為1 g時(shí)，懸浮細(xì)胞活力較低，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；接種量為2 g時(shí)，細(xì)胞增殖較快，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著增加(Plt;0.05)；當(dāng)接種量大于2 g時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著下降(圖1)。這可能是由于培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分不能滿足大量細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)時(shí)，在100 mL的1/2MS液體培養(yǎng)基中，愈傷組織細(xì)胞的最適接種量為2 g。

2.1.2光照對(duì)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的影響 在不同的光照培養(yǎng)下，細(xì)胞生長(zhǎng)率和細(xì)胞狀態(tài)有所不同(圖1)。當(dāng)為全天光照時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，細(xì)胞生長(zhǎng)量最高，且褐化較少，培養(yǎng)液清澈明亮透明；當(dāng)為12 h光照時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)率略低，出現(xiàn)一定褐化現(xiàn)象，培養(yǎng)液呈淺褐色；當(dāng)為全天黑暗時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)率最低，而且在培養(yǎng)2 h內(nèi)培養(yǎng)液全部變?yōu)楹稚?/p>

2.1.3培養(yǎng)液量對(duì)北細(xì)辛懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 懸浮培養(yǎng)時(shí)，需適宜的溶氧量以保證懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)液100 mL時(shí)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率最高，顯著高于70、130、160和190 mL培養(yǎng)液(Plt;0.05),是北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的最適宜裝液量(圖1)。當(dāng)培養(yǎng)液量為70 mL時(shí)，裝液量較少，導(dǎo)致細(xì)胞不能及時(shí)獲取營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)培養(yǎng)液量大于100 mL并逐漸增加時(shí)，裝液量較大，影響氧氣的供應(yīng)，致使細(xì)胞不易增殖，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率逐漸降低。

圖1 不同影響因素對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

注：不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(Plt;0.05)。

Note：Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level.

2.1.4轉(zhuǎn)速對(duì)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的影響 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)有一定的影響(圖1)。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在110～150 r·min-1時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量逐漸增加。搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1時(shí)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率最高，細(xì)胞分散較好。但當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速大于150 r·min-1時(shí)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率開(kāi)始下降，可能是由于搖床轉(zhuǎn)速過(guò)大時(shí)，剪切力過(guò)大，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或破裂。

2.1.5蔗糖濃度對(duì)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的影響 當(dāng)蔗糖濃度為30 g·L-1時(shí)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率最高(圖1)。當(dāng)蔗糖濃度為25 g·L-1時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)液變渾濁；而蔗糖濃度大于30 g·L-1并逐漸增加時(shí)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)率逐漸降低，不利于細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，這可能是由于較高的蔗糖濃度加大了培養(yǎng)基的滲透壓，不利于細(xì)胞吸收養(yǎng)分，阻礙了細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，北細(xì)辛愈傷組織細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)最適的蔗糖濃度為30 g·L-1。

2.1.6不同外源激素濃度配比對(duì)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)的影響 不同激素配比對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有一定的影響(圖1)。通過(guò)正交試驗(yàn)的直觀分析法，計(jì)算得出k6-BA 0.2、k6-BA 0.4、k6-BA 0.6分別為0.510、0.585、0.876，kNAA 0.3、kNAA 0.6、kNAA 0.9分別為0.695、0.648、0.629，說(shuō)明就6-BA而言，0.6 mg·L-1為最適水平，而NAA為0.3 mg·L-1。由極差分析得出，R6-BA為0.366，RNAA為0.066，因此說(shuō)明對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)影響最大的是6-BA。同時(shí)，圖1表明 0.6 mg·L-16-BA與0.3 mg·L-1NAA協(xié)同使用時(shí)，懸浮細(xì)胞生物量最大。

2.2北細(xì)辛懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化

北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)時(shí)以25 d為一個(gè)周期，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本為“S”形(圖2)。懸浮培養(yǎng)初期0-5 d為滯后期(圖3A)，細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢；5-15 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(圖3B)，細(xì)胞快速生長(zhǎng)并在15 d時(shí)達(dá)到最大；15 d后進(jìn)入了停滯期(圖3C和D)，細(xì)胞生長(zhǎng)不再有明顯變化，此時(shí)懸浮細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)褐化，有的甚至死亡，培養(yǎng)液逐漸變渾濁。因此,懸浮細(xì)胞的最佳收獲時(shí)期為15 d。

圖2 北細(xì)辛懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖3 北細(xì)辛懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程

注：A，懸浮培養(yǎng)初期(0-5 d)；B，懸浮培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(5-15 d)；C和D，懸浮培養(yǎng)停滯期(15 d后)。

Note: A, Initial duration of suspension culture(0-5 days); B, Logarithmic growth phase of suspension culture(5-15 days); C and D, Stagnation period of suspension culture(after 15 days).

2.3北細(xì)辛懸浮細(xì)胞形態(tài)觀察

本研究建立的懸浮培養(yǎng)體系是由愈傷組織細(xì)胞團(tuán)分裂成許多單細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體(圖4)。培養(yǎng)初期，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)條狀，有內(nèi)含物(圖5A)，生長(zhǎng)較慢；經(jīng)過(guò)多次繼代后，可形成二、三或多細(xì)胞團(tuán)(圖5B和C)，并產(chǎn)生許多不同狀態(tài)的單細(xì)胞：①較規(guī)則的圓球狀，內(nèi)含物豐富(圖5D)；②卵圓形，內(nèi)含物較少(圖5E)；③不規(guī)則橢圓形，內(nèi)含物較豐富(圖5F)；④草履蟲(chóng)狀，內(nèi)含物較豐富(圖5G)；⑤蝌蚪狀，內(nèi)含物較少(圖5H)。

圖4 北細(xì)辛懸浮細(xì)胞整體分裂過(guò)程

圖5 北細(xì)辛懸浮細(xì)胞形態(tài)

注：A，培養(yǎng)初期的細(xì)胞；B和C，多細(xì)胞團(tuán)；D-H，不同狀態(tài)的單細(xì)胞。

Note:A, cells of the initial culture period; B and C, multicellular aggregates; D-H, single cell in different states.

3 討論

藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是產(chǎn)生有效活性成分的重要途徑，而懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化主要涉及培養(yǎng)條件的篩選。已有研究發(fā)現(xiàn),接種量、光照、培養(yǎng)液量、轉(zhuǎn)速、蔗糖、外源激素等是影響懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的主要因素[9-10]。較適宜的幾種影響因素相互協(xié)調(diào)使用可建立起穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞，如，方文娟等[11]在草地早熟禾(Poapratensis)中建立的懸浮細(xì)胞系；單一來(lái)說(shuō)，在懸浮培養(yǎng)時(shí)，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)具有群體效應(yīng)，初始接種量較低時(shí)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)活力低，阻礙了細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，細(xì)胞逐漸衰老死亡；初始接種量較高時(shí)，細(xì)胞迅速分裂生長(zhǎng)，從而大量消耗了培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)早處于饑餓狀態(tài)，過(guò)早衰老，不利于懸浮細(xì)胞系的建立[12]。一些研究表明,不同植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中最適初始接種量不盡相同，廖禮佳等[14]研究認(rèn)為長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的最佳接種量為60 g·L-1，而劉小英[9]進(jìn)行枇杷懸浮培養(yǎng)時(shí)篩選出初始接種量為80 g·L-1，本研究發(fā)現(xiàn)北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)時(shí)100 mL培養(yǎng)液接入2 g愈傷組織細(xì)胞為最好，即最適接種量為20 g·L-1。北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)最適接種量低可能是由于北細(xì)辛懸浮細(xì)胞產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)，過(guò)多積累將影響細(xì)胞的進(jìn)一步生長(zhǎng)和增殖。

光照在一定程度上影響著懸浮細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)分化[15]。王莉[16]研究認(rèn)為懸浮培養(yǎng)時(shí)介入一定量的光照，有利于生物量的提高，但是全程介入光照反而不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂。有所不同的是,本研究發(fā)現(xiàn)在全天光照下北細(xì)辛懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，很少出現(xiàn)褐化，可能說(shuō)明不同物種懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律有所不同，具體原因尚需進(jìn)一步探討。

外源激素是植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一，其種類(lèi)和濃度配比對(duì)于懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖都有很大影響[17]。郭紫鵑[18]在進(jìn)行白背三七(Gynuradivaricata)懸浮培養(yǎng)時(shí)，采用培養(yǎng)基B5+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基條件建立了良好的懸浮培養(yǎng)體系。而劉小英[9]在枇杷懸浮培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)使用單一植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。基于前期北細(xì)辛葉柄愈傷組織誘導(dǎo)、增殖研究結(jié)果[5]，懸浮培養(yǎng)時(shí)仍同時(shí)選用6-BA和NAA，研究發(fā)現(xiàn)0.6 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA的濃度組合更利于懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，高于愈傷組織增殖培養(yǎng)時(shí)的最適濃度。建立的北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)體系中可獲得多種形態(tài)的單細(xì)胞，與杜仲(Eucommiaulmoides)細(xì)胞培養(yǎng)相似[19]。目前，尚未見(jiàn)與北細(xì)辛同屬或同科植物的懸浮培養(yǎng)報(bào)道，因此本研究結(jié)果不僅可為后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)北細(xì)辛天然活性成分奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為同屬或同科近緣物種的細(xì)胞培養(yǎng)提供一定的借鑒。

4 結(jié)論

由北細(xì)辛葉柄愈傷組織建立了懸浮培養(yǎng)體系，篩選的最佳培養(yǎng)條件為100 mL的1/2MS液體培養(yǎng)基接入2 g愈傷組織細(xì)胞，0.6 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，30 g·L-1(3%)蔗糖，全天光照培養(yǎng)。

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(責(zé)任編輯 王芳)

EstablishmentandoptimizationofasuspensionculturesystemforculturingAsarumheterotropoides

Liu Si-yu, Yang Yue, Wang Ying, Wang Li-juan, Wu Xiu-ju

(College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China)

Using the callus induced by young petioles ofAsarumheterotropoides, a suspension culture system was established. Then the effects of the amount of inoculum, lighting time, amount of culture fluid, speed of rotation, and concentrations of sucrose and plant growth regulators on the cell suspension culture ofA.heterotropoideswere studied. The results showed that the optimal conditions for callus suspension culture were 2 g calli inoculated in 100 mL 1/2 MS liquid medium containing 0.6 mg·L-16-BA and 0.3 mg·L-1NAA, a rotation speed of 150 r·min-1, 30 g·L-1sucrose, and exposure to whole-day light. The growth curve of suspension cells ofA.heterotropoideswas S-type. The best harvest time of suspension cells was 15 d. Through the suspension culture, the cell masses and various forms of single cells could be obtained rapidly. These findings provide the basis for large-scale culture ofA.heterotropoidessuspension cells so as to enhance the application value ofA.heterotropoides.

Asarumheterotropoides; callus; suspension culture; cell biomass; culture condition; mass production

Wu Xiu-ju E-mail:xiujuwu@neau.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0029

劉思妤，楊?lèi)?，王鷹，王麗娟，吳秀?北細(xì)辛懸浮培養(yǎng)體系的建立及優(yōu)化.草業(yè)科學(xué),2017,34(11)：2254-2260.

Liu S Y,Yang Y,Wang Y,Wang L J,Wu X J.Establishment and optimization of a suspension culture system for culturingAsarumheterotropoides.Pratacultural Science，2017,34(11)：2254-2260.

S567.048

A

1001-0629(2017)11-2254-07

2017-01-07接受日期2017-05-02

國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金能力培養(yǎng)與科研訓(xùn)練項(xiàng)目(J1210069)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目計(jì)劃(12531030)；哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才研究專(zhuān)項(xiàng)(2012RFLXN003)

劉思妤(1992-)，女，天津人，在讀碩士生，研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)。E-mail：2360204975@qq.com

吳秀菊(1972-)，女，黑龍江蘿北人，教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)。E-mail：xiujuwu@neau.edu.cn