石玉梅 馬 杰

單縣海吉亞醫(yī)院兒科（ 山東單縣 274300）

先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血患兒臨床表現(xiàn)及基因檢測(cè)

石玉梅 馬 杰

單縣海吉亞醫(yī)院兒科（ 山東單縣 274300）

目的探討先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血（DBA）的臨床特點(diǎn)及其致病基因。方法回顧分析2例DBA患兒的臨床資料以及基因檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果兩例患兒均為女性，分別為3月齡和4月齡；均以面色蒼黃就診。血常規(guī)紅細(xì)胞偏低、血紅蛋白低、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)低；血清鐵及鐵蛋白均升高；紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)異常。骨髓細(xì)胞學(xué)均提示髓象幼紅細(xì)胞罕見(jiàn)?；驒z測(cè)，例1的RPS19存在c.91C＞T（p.P31S）雜合突變，其父母未見(jiàn)突變，該突變?yōu)樾掳l(fā)突變，經(jīng)驗(yàn)證為致病基因；例2的RPL5基因存在c.472_473del缺失突變（p.K158fs），為已知致病基因。結(jié)論DBA患兒多在出生早期發(fā)病，臨床表現(xiàn)為紅系缺乏，RPS19及RPL5基因突變較常見(jiàn)，相關(guān)基因檢測(cè)有利于早期診斷；c.91C＞T（p.P31S）雜合突變?yōu)槲匆?jiàn)報(bào)道的新突變。

先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血； 臨床特點(diǎn)； 基因檢測(cè)

先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血又稱(chēng)Diamond-Blackfan貧血（Diamond-Blackfan anemia，DBA；MIM 105650）是一種先天性骨髓衰竭性疾病[1]，因Diamond和Blackfan于1938年首先報(bào)道而得名。其血液學(xué)特點(diǎn)為巨幼紅細(xì)胞性貧血，網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)減少，骨髓增生較活躍，粒系、巨核系細(xì)胞增生正常，而紅系細(xì)胞明顯缺乏[2]。歐美國(guó)家DBA的發(fā)病率為0.05/萬(wàn)～0.07/萬(wàn)[3]，國(guó)內(nèi)暫沒(méi)有DBA發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。一種編碼核糖體小亞基蛋白19基因（RPS19）首先被證實(shí)與DBA發(fā)病相關(guān)，隨后研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)與DBA相關(guān)的其他核糖體蛋白基因，包括RPS17、RPL5、RPS24、RPS7等[4-6]?，F(xiàn)回顧分析2例DBA患兒的臨床資料，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí)，探討DBA的臨床表現(xiàn)及基因變異特點(diǎn)。

1 臨床資料

例1，女，3月齡，因“面色蒼黃近1個(gè)月”來(lái)單縣海吉亞醫(yī)院兒科就診。無(wú)發(fā)熱、嘔吐、抽搐，大小便未見(jiàn)異常。入院后體格檢查：貧血面容，神志清楚，全身皮膚未見(jiàn)皮疹；雙側(cè)呼吸對(duì)稱(chēng)，心律齊，心音有力，各聽(tīng)診區(qū)未聞及雜音。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)紅細(xì)胞1.24×1012/L，白細(xì)胞4.28×109/L，血小板448×109/L，血紅蛋白46 g/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)4.1×109/L，紅細(xì)胞平均體積108.4 fL（參考值75～121 fL），紅細(xì)胞平均血紅蛋白量34.5 pg（25～35 pg），紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度328 g/L （290～370 g/L）；血清鐵44.3 mmol/L，鐵蛋白469.2 ng/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白在正常范圍內(nèi)；紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)顯示在 0.50% NaCl濃度下開(kāi)始溶血，在0.28% NaCl濃度下完全溶血，結(jié)果未見(jiàn)異常；肝腎功能、心肌酶譜等指標(biāo)未見(jiàn)異常。骨髓細(xì)胞學(xué)顯示：髓象幼紅細(xì)胞罕見(jiàn)，其中紅系比例約3%，幼紅細(xì)胞罕見(jiàn)（早幼紅未見(jiàn)，中幼紅細(xì)胞1.5%，晚幼紅細(xì)胞1.3%）；粒細(xì)胞比例約為61%，淋巴細(xì)胞比例約為26%，單核細(xì)胞比例約為5%。彩色超聲：左向右分流卵圓孔未閉或房間隔缺損。胸片：雙肺紋理增強(qiáng)，未見(jiàn)實(shí)質(zhì)性病變。

例2，女，4月齡，因“面色蒼黃近并進(jìn)行性加重十余天”來(lái)院就診。入院體格檢查：貧血面容，神志清楚，全身皮膚未見(jiàn)皮疹；雙側(cè)呼吸對(duì)稱(chēng)，心尖區(qū)可聞及收縮期雜音；四肢未見(jiàn)異常，活動(dòng)無(wú)受限。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)紅細(xì)胞1.48×1012/L，白細(xì)胞5.61×109/L，血小板485×109/L，血紅蛋白39 g/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞4.3×109/L，紅細(xì)胞平均體積94.2 fL；血清鐵41.5 mmol/L，鐵蛋白491.7 ng/mL。骨髓細(xì)胞學(xué)顯示：紅系比例較低（＜1%，早幼紅細(xì)胞未見(jiàn)，中幼紅約0.5%，晚幼紅低于0.5%），有核紅細(xì)胞罕見(jiàn)，粒細(xì)胞比例約為64%，淋巴細(xì)胞比例為28%，單核細(xì)胞約為6%，純紅細(xì)胞再生障礙性貧血（PRCA）可能性大。胸片顯示雙肺紋理增強(qiáng)。心臟彩超未見(jiàn)明顯異常?；純撼錾鷷r(shí)無(wú)異常，父母雙方均無(wú)類(lèi)似疾病家族史。

為進(jìn)一步明確診斷，對(duì)患兒進(jìn)行DBA相關(guān)基因突變分析。經(jīng)患者家屬知情同意后，取患兒新鮮外周靜脈血2 mL，送華大基因公司進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)，并利用sanger測(cè)序驗(yàn)證。

測(cè)序結(jié)果顯示：例1的RPS19基因4號(hào)外顯子上存在c.91C＞T（p.P31S）雜合突變（圖1）。該突變?yōu)殄e(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的RPS19蛋白在31位由脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，患兒父母在該位點(diǎn)均未見(jiàn)突變。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)及千人基因數(shù)據(jù)庫(kù)（1000genomes）分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)不是多態(tài)性位點(diǎn)。RPS19基因c.91C＞T（p.P31S）突變?yōu)槲匆?jiàn)報(bào)道的新發(fā)突變，利用Polyphen2軟件（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）預(yù)測(cè)得分為 1.00（得分越接近1說(shuō)明致病的可能性很大）；SIFT（http://sift.jcvi.org/）預(yù)測(cè)的結(jié)果為0.00（越接近0，對(duì)蛋白功能影響越大）。利用不同的物種之間保守序列分析發(fā)現(xiàn)RPS19蛋白31位的脯氨酸十分保守，說(shuō)明該位點(diǎn)維持蛋白正常功能具有重要的作用。

例2 的RPL5基因存在c.472_473del缺失突變，該突變會(huì)引起編碼的RPL5蛋白在158位的賴(lài)氨酸處產(chǎn)生移碼突變（p.K158fs），該位點(diǎn)為已知的致病性突變?；颊叩母改冈撐稽c(diǎn)未見(jiàn)突變（圖2）。

圖1 例1患兒及其父母RPS19基因檢測(cè)結(jié)果

圖2 例2患兒及其父母RPL5基因檢測(cè)結(jié)果

2例患兒入院以后均進(jìn)行相應(yīng)的治療。因患兒均不足6個(gè)月，住院期間對(duì)于貧血癥狀的治療采用輸注紅細(xì)胞等。出院時(shí)例1的血紅蛋白為86 g/L，例2為90 g/L。出院后繼續(xù)口服甲潑尼龍片，4 mg/d。定期隨訪復(fù)查血常規(guī)，根據(jù)病情變化及時(shí)調(diào)整治療方案。

2 討論

DBA屬于少見(jiàn)的遺傳性骨髓衰竭性疾病中的一種，但在兒童先天性骨髓衰竭性疾病中的比例較高，僅次于范可尼貧血，現(xiàn)已將該病歸類(lèi)于核糖體疾病[7]。DBA一般在出生幾個(gè)月以?xún)?nèi)起病，男女發(fā)病率約為1.1:1，大部分為散發(fā)病例，10%～25%的患者有家族史[8]。約1/3的DBA患者合并發(fā)育遲緩、尿道畸形、矮小、斜視、先天性心臟病以及拇指三指節(jié)畸形等癥狀。此外該類(lèi)患兒易患急性非淋巴細(xì)胞白血病及非造血系統(tǒng)腫瘤[9，10]。DBA患者的紅細(xì)胞生成障礙主要存在于紅系造血集落至紅系原始細(xì)胞這一階段中[11]。

DBA的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，推測(cè)可能與紅系祖細(xì)胞內(nèi)在性質(zhì)異常、Epo信號(hào)通路異常、紅系造血調(diào)控異常以及核糖體相關(guān)蛋白的功能異常有關(guān)。常規(guī)集落培養(yǎng)顯示，DBA患者骨髓紅系祖細(xì)胞（BFU-E、CFU-E）顯著減少[9,12]。RPS19蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與DBA發(fā)病相關(guān)的核糖體蛋白，該蛋白非常保守，通過(guò)與其相互作用分子發(fā)揮生物學(xué)活性，現(xiàn)已明確的RPS19相互作用分子包括有SI9BP、18SrRNA、Neplp、PIM-1和FGF-2[13，14]。研究發(fā)現(xiàn)，RPS19可能參與40S核糖體前體的組裝和成熟，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控功能?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，單純RPS19缺乏即可導(dǎo)致40S核糖體亞基的形成異常[15]。目前研究人員已經(jīng)進(jìn)一步建立了RPS19基因突變的斑馬魚(yú)動(dòng)物模型，用于進(jìn)一步探索DBA的發(fā)病機(jī)制以及新的治療方法。RPL5基因位于1p22.1區(qū)域，其編碼的蛋白屬于核糖體60S的一個(gè)亞單位，且該蛋白可結(jié)合5S rRNA形成RNP，維持核糖體的正常功能[16]。

本組例1患兒，因面色蒼黃近1個(gè)月入院治療，發(fā)現(xiàn)其貧血嚴(yán)重，骨髓細(xì)胞學(xué)顯示幼紅細(xì)胞罕見(jiàn)，再根據(jù)網(wǎng)織紅細(xì)胞等其他臨床檢測(cè)推測(cè)患DBA可能。國(guó)內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)約1/3的DBA患者合并先天發(fā)育畸形等癥狀，例1患兒經(jīng)過(guò)系統(tǒng)檢查后發(fā)現(xiàn)左向右分流卵圓孔未畢或房間隔缺損。為進(jìn)一步明確診斷，對(duì)患者進(jìn)行DBA相關(guān)致病基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患兒RPS19基因存在c.91C＞T（p.P31S）雜合突變。根據(jù)生物信息學(xué)軟件的分析預(yù)測(cè)并結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)，推測(cè)該位點(diǎn)為致病性位點(diǎn)，但結(jié)論需要進(jìn)一步細(xì)胞水平及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。例2存在相似的臨床表現(xiàn)，基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在c.472_473del缺失雜合突變，該突變?yōu)橐呀?jīng)證實(shí)的致病性變異[16]

研究發(fā)現(xiàn)，約25%的DBA患者有RPS19基因突變，2%的DBA存在RPS24基因突變[9]。另有研究表明，編碼核糖體蛋白的RPS17基因、RPL5基因、RPL11基因以及RPL35a基因突變也可導(dǎo)致DBA的發(fā)生，此外連鎖分析發(fā)現(xiàn)位于8p23-8p22以及1q31的未知基因可能與DBA發(fā)病相關(guān)[17]。目前高通量測(cè)序技術(shù)較為成熟，疑似患兒可進(jìn)行相關(guān)致病基因檢測(cè)以協(xié)助臨床進(jìn)行診斷。不同基因型的異?？赡軐?dǎo)致不同的臨床表型。研究發(fā)現(xiàn)，RPL5與RPL11基因突變與DBA畸形發(fā)生相關(guān)[18]；核糖體蛋白基因突變陽(yáng)性的DBA患兒畸形發(fā)生率＞40%，明顯高于無(wú)突變患兒，其中攜帶RPL5與RPL11基因突變者易伴有指/趾畸形，而攜帶RPS19基因突變者易產(chǎn)生尿道畸形[6]。本組2例患兒未見(jiàn)相似畸形發(fā)生。

DBA的治療手段主要以糖皮質(zhì)激素、紅細(xì)胞輸注以及造血干細(xì)胞移植為主，其中糖皮質(zhì)激素為DBA的一線治療藥物[19]。國(guó)內(nèi)對(duì)50例接受潑尼松治療的DBA患兒分析顯示，其治療反應(yīng)率為64.0%，多數(shù)患兒治療1個(gè)月以?xún)?nèi)見(jiàn)效，15例患兒獲得緩解，其中5例停藥，10例口服潑尼松維持治療[6]。DBA患兒對(duì)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的差異可能與機(jī)體內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的多態(tài)性相關(guān)[20]，今后可對(duì)此進(jìn)行遺傳學(xué)差異分析。

綜上所述，DBA患兒起病年齡較早，多在1歲以?xún)?nèi)，臨床表現(xiàn)為巨幼紅細(xì)胞性貧血、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)減少、紅系細(xì)胞明顯缺乏等，核糖體相關(guān)蛋白基因突變?yōu)閷?dǎo)致DBA的常見(jiàn)病因?；騝.91C＞T（p.P31S）位點(diǎn)突變未見(jiàn)報(bào)道，依據(jù)患兒的相關(guān)臨床表現(xiàn)及針對(duì)編碼核糖體蛋白的基因突變篩查有利于DBA的診斷及盡早治療。

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2017-02-15）

（本文編輯：梁 華）

Clinical features of Diamond-Blackfan anemia and gene testing

SHI Yumei,MA Jie（Department of Paediatrics，Shanxian Hygeia Hospital，Shanxian 274300，Shandong,China）

ObjectiveTo investigate the clinical and genetic features of Diamond-Blackfan anemia (DBA).MethodThe clinical manifestations and genetic tests of 2 cases with DBA were retrospectively analyzed,and the related literatures were reviewed.ResultsTwo female patient （3-4 month old）with progressive ochriasis nearly a month was included.Fever,seizure,vomit and abnormal change in urine and stool routine test were not shown.Blood routine test: the number of RBC in the two patients was decreased（1.24 ×1012/L and 1.48×1012/L）,HGB (46 g/L and 39 g/L）,and the number of RTC was also decreased(4.1×109/L and 4.3×109/L),RCV was normal (108.4 fl).Serum iron determination: Fe (44.3 mmol/L and 41.5 mmol/L) and ferritin (469.2 mmol/L and 491.7 ng/mL) were increased,transferrin was in the normal range.Erythrocyte fragility test resulted normal.Bone marrow examination found rarely erythroblasts.A novel heterozygous mutation inRPS19gene,c.91C＞T（p.P31S）,was found by genetic testing on patient 1.And we found a heterozygous mutation inRPL5gene (c.472_473del) in patient 2.Conclusion The majority of onset age of childhood DBA was within a few months with a erythroid de fi ciency.AndRPS19gene mutation is a common cause of this disease.The mutation of c.91C＞T (p.P31S) has not been reported.

Diamond-Blackfan anemia; clinical manifestations; genetic testing

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.11.012