孫 杭 張憲偉

南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科（江蘇南京 210008）

膿毒癥患兒免疫抑制與多器官功能障礙相關性研究

孫 杭 張憲偉

南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科（江蘇南京 210008）

目的研究膿毒癥患兒免疫水平與病情嚴重程度的相關性，探討免疫抑制對器官功能損害的影響。方法回顧分析375例膿毒癥患兒的臨床資料，分析患兒轉入重癥監(jiān)護室24小時內免疫功能指標與器官損害數之間的關系；Logistic逐步回歸分析發(fā)生多器官功能障礙綜合征（MODS）及院內死亡的風險因素。結果375例膿毒癥患兒中位年齡8.7個月（1個月～13歲），男228例、女147例，男女比例約1.55 :1。依據治療期間發(fā)生功能障礙的器官數目，將膿毒癥患兒分為無器官功能障礙組、單器官功能障礙組及多器官功能障礙組。三組間NK細胞百分比，CD4/CD8比值，補體C3、C4水平的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），以多器官功能障礙組最低。Logistic多因素回歸分析顯示，CD4/CD8比值（OR=0.66，95%CI：0.51～0.85）、補體C3（OR=0.20，95%CI：0.10～0.42）、中樞神經系統(tǒng)感染（OR=2.54，95%CI：1.35～4.77）和肺部感染（OR=2.29，95%CI：1.36～3.83）是MODS發(fā)生的影響因素；補體C3（OR=0.26，95%CI：0.09～0.76）及肺部感染（OR=2.61，95%CI：1.12～6.09）為膿毒癥患兒院內死亡的影響因素。結論膿毒癥患兒的免疫抑制與MODS發(fā)生有相關性，CD4/CD8比值降低以及補體C3消耗可作為評估膿毒癥患兒MODS發(fā)生風險的免疫學指標。

膿毒癥； 多器官功能障礙綜合征； 免疫抑制

膿毒癥患兒常伴有高熱、休克及呼吸衰竭等癥狀，傳統(tǒng)理論認為膿毒癥是一種失控的炎癥反應，因為研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者體內炎癥因子如腫瘤壞死因子（TNF）、白介素1（IL-1）等升高，且將這些炎癥因子注入動物體內后亦會導致一系列膿毒癥相關癥狀[1]。但在膿毒癥治療的相關研究中，無論是TNF、IL-1拮抗劑或者以阻斷Toll樣受體（TLR受體）、阻斷內毒素傳導為目的等藥物對膿毒癥患者或膿毒癥動物模型的治療都未能達到預期的改善作用[2,3]。目前已有一些旨在阻斷炎癥反應或免疫激活的藥物用于臨床試驗，這種治療方法也許在膿毒癥早期處于炎癥反應過度活化階段有用，但在膿毒癥后期，這種治療方法或許并無益處，可能導致機體更易遭受再次感染[4]。近年來越來越多的研究表明，膿毒癥患者體內存在著免疫抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為免疫細胞數目的減少以及細胞功能的喪失[5]。本研究回顧性分析膿毒癥患兒細胞免疫、體液免疫指標與多器官功能障礙以及預后的關系，為了解膿毒癥病情進展的機制及研究新的治療方法提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2013年1月至2016年1月間，南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院內、外科重癥監(jiān)護室收治的膿毒癥患兒375例，主要為膿毒癥伴肺部感染、胃腸道感染、皮膚軟組織感染、中樞神經系統(tǒng)感染、腹腔感染或腹部術后等。研究對象入選標準：①年齡1個月至14歲；②符合中華醫(yī)學會兒科學分會急救組、中華醫(yī)學會急診學分會兒科組等制定的膿毒癥及多器官功能障礙相關診療方案[6,7]；③轉入重癥監(jiān)護室后24小時內采集過血液進行免疫學相關檢測；④排除因白血病、淋巴瘤或其他實體腫瘤而接受化療、放療，長期或大量應用糖皮質激素治療，先天性免疫缺陷或自身免疫性疾病等患兒。

依據患兒在ICU治療過程中發(fā)生功能障礙的器官數目，將患兒分為無器官功能障礙、單器官功能障礙及多器官功能障礙3組。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患兒性別、年齡、免疫學檢測指標、臨床診斷及結局等信息。免疫學指標在患兒轉入重癥監(jiān)護室的24小時內采集血液標本檢測。

1.2.2 淋巴細胞免疫分型 使用美國BD公司BD FACS Calibur流式細胞儀，檢測指標有T細胞百分比（CD3+）、CD4+T細胞百分比（CD3+、CD4+）、CD8+T細胞百分比（CD3+、CD8+）、NK細胞百分比（CD3－、CD16+、CD56+）、B細胞百分比（CD3－、CD19+）。

1.2.3 體液免疫分析 使用德國西門子公司的德靈BN2全自動特定蛋白分析儀，檢測血清補體C3、C4濃度。

1.2.4 血常規(guī)分析 使用日本Sysmex公司XE-2100全血細胞分析儀，檢測中性粒細胞計數、淋巴細胞計數等。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用Stata 12.0進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數（四分位數間距）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。計數資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。使用多元logistic逐步后退法篩選出與膿毒癥患兒發(fā)生多器官功能障礙綜合征（MODS）、院內死亡相關的免疫學指標。納入logistic回歸方程的自變量包括性別，年齡，是否有肺部感染、胃腸道感染、中樞神經系統(tǒng)感染、皮膚軟組織感染、腹腔感染或腹部手術后，中性粒細胞計數，淋巴細胞計數，T細胞百分比，CD4/CD8，NK細胞百分比，B細胞百分比，補體C3、C4血清濃度等。其中性別以及是否有上述原發(fā)感染病灶為二分類變量，其余為連續(xù)性變量，回歸方程剔除變量的P為0.10，選入變量的P為0.05。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般情況

共375例膿毒癥患兒納入研究，中位年齡8.7個月（1個月～13歲），男性228例、女性147例，男女比例約1.55:1。膿毒癥患兒最常見感染病灶為肺部感染，占54.7%，其次為胃腸道感染（24.3%）、顱內感染（16.5%）、腹腔感染或腹部術后（12.0%）、皮膚軟組織感染（4.8%），約25.9%的患兒存在2個或以上的感染灶。膿毒癥患兒器官功能受累最常見為肝臟（30.9%）、心血管（30.9%）、中樞神經系統(tǒng)（28.3%）以及呼吸系統(tǒng)（24.2%）。有96例（25.6%）患兒進展為MODS，33例（9.6%）在治療期間死亡。

2.2 免疫學指標與器官功能障礙相關性單因素分析

375例膿毒癥患兒中無器官功能障礙組183例、單器官功能障礙組96例、多器官功能障礙組96例，三組患兒年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。CD4+T細胞百分比、CD4/CD8比值、NK細胞百分比和補體C 3在三組間的差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），上述指標在MODS組均為最低。其余免疫指標如淋巴細胞計數、T細胞百分比、B細胞百分比等組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 Logistic回歸分析與MODS相關的因素

將肺部感染、胃腸道感染等原發(fā)感染因素與性別、年齡以及NK細胞百分比、CD4/CD8比值等免疫指標納入logistic逐步回歸方程，分析結果顯示，中樞神經系統(tǒng)感染（OR=2.54，95%CI：1.35～4.77）、肺部感染（OR=2.29，95%CI：1.36～3.83）為MODS發(fā)生的獨立危險因素；而CD4/CD8比值（OR=0.66，95%CI：0.51～0.85）和補體C3濃度高（OR=0.20，95%CI：0.10～0.42），則膿毒癥患兒發(fā)生MODS的風險低，為MODS發(fā)生的保護因素。見表2。

2.4 Logistic回歸分析影響院內死亡的相關因素

Logistic回歸分析結果表明，肺部感染為膿毒癥患兒院內死亡的獨立危險因素（OR=2.61，95%CI:1.12～6.09），而補體C3是院內死亡發(fā)生的保護因素（OR=0.26，95%CI: 0.09～0.76），C3濃度每升高1 g/L，患兒死亡風險降為原來0.26倍。見表3。

表1 不同器官功能障礙分組各指標比較[M(P25～P75)]

3 討論

本研究表明，相對于一般膿毒癥，多器官功能障礙的重癥膿毒癥患兒NK細胞百分比、CD4/CD8比值、補體C3等顯著降低，且多元回歸分析表明，CD4/CD 8比值降低與補體C 3降低是膿毒癥患兒發(fā)生MODS的危險因素，此外補體C3亦可作為評估膿毒癥患兒短期預后的參考指標。

表2 影響膿毒癥患兒發(fā)生MODS的相關因素分析

表3 影響膿毒癥患兒生存情況的因素分析

近年來越來越多的研究表明，膿毒癥患者體內存在著免疫抑制的現(xiàn)象，主要為淋巴細胞數目減少及功能失常。淋巴細胞絕對數目的減少表現(xiàn)為CD4+T細胞、CD8+T細胞及B細胞等的凋亡[8,9]。研究人員對死于膿毒癥患者的脾臟及動脈周圍淋巴鞘組織進行切片免疫組化檢查的結果表明，膿毒癥患者外周免疫器官內的CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞及樹突狀細胞減少[10,11]。另外，對淋巴細胞功能的相關研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，膿毒癥患者組織細胞表面的T細胞抑制性配體表達上調，表明T細胞的免疫功能受到抑制，如膿毒癥患者脾臟血管內皮細胞的T細胞抑制性配體PD-L1表達上調，CD86與人類白細胞抗原DR位點（HLA-DR）在脾臟與肺組織中表達下調，脾臟中調節(jié)性T細胞數目增多，表明膿毒癥患者脾臟與肺的淋巴細胞處于免疫抑制狀態(tài)[12]。此外，在念珠菌血行感染所致的膿毒癥患者中，可以觀察到CD4+T細胞表面協(xié)同共刺激分子CD28的表達下調，T細胞表面程序性死亡分子1及其配體（PD-1/PD-L1）表達上調，表明真菌性膿毒癥患者體內T細胞亦處于免疫抑制狀態(tài)[13]。CD4+T細胞可分為Th1、Th2和Th17等類型。轉錄因子T-bet、GATA3是調節(jié)Th1、Th2細胞分化的關鍵因素，研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷以及膿毒癥患者中，T-bet與GATA3表達顯著降低，表明Th1、Th2細胞都處于免疫抑制狀態(tài)[14]。還有研究表明，調節(jié)Treg細胞的轉錄因子FOXP3的表達在膿毒癥患者中并無變化，表明膿毒癥患者體內效應T細胞功能被抑制而調節(jié)性T細胞功能則維持或增加[15]，進一步證實T細胞功能被抑制。本研究也發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞、CD4/CD8比值等在MODS重癥膿毒癥患兒中顯著降低，而CD8+T細胞在各組間無明顯差異，表明膿毒癥患兒T細胞免疫功能受抑制是病情進展的重要原因。

除T、B細胞外，NK細胞也在機體對抗感染的免疫過程中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞百分比在多器官損害的膿毒癥患兒中顯著降低，表明重癥膿毒癥患兒體內存在固有免疫系統(tǒng)功能受抑制的現(xiàn)象。相關研究表明，膿毒癥患者NK細胞的細胞毒作用以及細胞因子分泌功能都受到影響[16]，膿毒癥患者外周血NK細胞絕對值減少[17]，NK細胞的細胞因子分泌功能也受到抑制，如IFNγ的分泌明顯降低[18]。作為機體固有免疫的重要組成部分，NK細胞免疫功能受到抑制使機體更易出現(xiàn)二次感染[5]，導致病情惡化。本研究同時發(fā)現(xiàn)，相比較非MODS患兒，中性粒細胞計數在MODS組并沒有降低。有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者中性粒細胞凋亡受到抑制，可能與全身炎癥反應綜合征（SIRS）甚至是器官損害相關[19]，中性粒細胞凋亡比例與膿毒癥病情嚴重程度以及預后無統(tǒng)計學相關性[20]。

上述相關機制的研究表明，膿毒癥患者淋巴細胞減少是一種與病情進展相關的重要病理現(xiàn)象，也是膿毒癥患者免疫抑制的主要原因。而膿毒癥誘導的淋巴細胞凋亡是淋巴細胞減少的主要病理生理機制[5,17]。膿毒癥誘導的細胞凋亡主要通過死亡受體通路及線粒體通路[5]。有研究將膿毒癥小鼠死亡受體凋亡通路以及線粒體凋亡通路的關鍵基因敲除，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞凋亡比例減少，小鼠的預后得到改善[21]；而使用caspase抑制劑以及死亡受體阻斷劑等[5,22]，同樣可以減少淋巴細胞的凋亡從而提高膿毒癥小鼠的生存率。上述研究提示，對于膿毒癥患兒的治療，可考慮從增加其免疫功能，減少免疫細胞的凋亡，提高免疫細胞的功能等方面著手。

補體C3水平在多器官損害的膿毒癥患兒中顯著降低，且多因素回歸分析提示，補體C3降低則MODS發(fā)生可能性升高，且是膿毒癥患兒院內死亡的危險因素。有研究表明，補體C3、C4、C5的裂解產物C3a、C4a、C5a在因膿毒癥死亡患者中的血漿濃度更高[23,24]。表明膿毒癥患者體內存在著補體系統(tǒng)的過度活化，提示多器官損害患兒的血漿C3水平降低可能是補體系統(tǒng)過度活化導致的C3過度消耗所致。補體系統(tǒng)與凝止血及抗纖溶系統(tǒng)間存在復雜的交叉激活網絡，補體系統(tǒng)的過度活化與凝血系統(tǒng)激活以及纖溶系統(tǒng)的抑制息息相關。凝血酶、纖溶酶等能夠裂解C3從而啟動相應的補體活化途徑。同時，補體活化過程中產生的C5a能誘導組織因子表達進而激活并放大凝血級聯(lián)反應，嚴重時可導致彌散性血管內凝血[25]。此外，C5a可誘導肥大細胞表達纖溶酶原激活抑制物1（PAI1）從而抑制纖溶作用[26]。因此，補體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)以及抗纖溶系統(tǒng)間的交叉激活網絡可導致膿毒癥患者凝止血、纖溶系統(tǒng)功能失常，使病情惡化。

本研究表明，淋巴細胞減少所致的免疫抑制及補體系統(tǒng)過度活化是膿毒癥患兒病情進展或惡化的重要因素。重癥膿毒癥的治療不應局限于控制患兒的炎癥反應，更需要恢復患兒的免疫功能。

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2017-05-31)

(本文編輯：蔡虹蔚)

Analysis of correlation between immunosuppression and organ dysfunction in children with sepsis

SUN Hang,ZHANG Xianwei (Clinical Laboratory ,Children’s Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210008,Jiangsu,China)

ObjectiveTo analyse the relationship between immunosuppression and severity of sepsis in children,thus to explore the role of immunity in the progression of sepsis and provide a reference for the treatment of sepsis in children.MethodsIn this retrospective study,375 children with sepsis were included.Blood specimens were collected for the analysis of lymphocyte subsets and humoral immunity in 24 hours after admission into ICU.Univariate analysis was performed between immunity indices and organ dysfunction.Logistic stepwise regression was used to screen out the risk factors of multiple organ dysfunction (MKDS) and mortality.ResultsSepsis children were divided into three groups,no organ dysfunction,single organ dysfunction and multiple organ dysfunction.NK cell percentage,CD4/CD8 and C3 were different among three groups,and signi fi cantly lower in MODS children.Multivariate analysis showed decreased CD4/CD8 (OR=0.66,95%CI:0.51-0.85).C3 level (OR=0.20,95%CI:0.10-0.42) were associated with MODS.CNS infection (OR=2.54,95%CI:1.35-4.77) and pneumonia infection (OR=2.29,95%CI:1.36-3.83) were also risk factors of MODS.Depletion of C3 (OR=0.26,95%CI:0.09-0.76) and pneumonia infection (OR=2.61,95%CI:1.12-6.09) were risk factors of mortality.ConclusionsCD4/CD8 and complement C3 were signi fi cantly decreased in sepsis children with MODS,immunosuppression may play an important role in the development of MODS in children with sepsis.Baseline CD4/CD8 and C3 level could be potential prognostic markers of sepsis.

sepsis; multiple organ dysfunction syndrome; immunosuppression

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.11.008

孫杭 電子信箱：sunhang85@yahoo.com