董云峰 趙秀峰 徐曉陽

1山西大同大學(xué)體育學(xué)院（山西大同 037009）

2泰山學(xué)院體育學(xué)院（山東泰安 271000）

3華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院（廣東廣州 510006）

Nrf2/ARE信號(hào)通路是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中最重要的通路之一，它是指被活化的核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor2，Nrf2）與 Keap1（Kelchlike ECH-associated protein1，Keap1）解離，解離后從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核同時(shí)會(huì)與在核內(nèi)的Nrf2蛋白結(jié)合，并且在生成異二聚體后再與抗氧化元件（antioxidant response element，ARE）序列結(jié)合進(jìn)而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄的整個(gè)表達(dá)路徑[1]。有研究證明，激活后的Nrf2-ARE信號(hào)通路不但可以抑制Nrf2蛋白降解，使Nrf2蛋白處于比較穩(wěn)定狀態(tài)，而且還會(huì)使Nrf2蛋白的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)[2]，這就形成了一種正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，這種機(jī)制的源頭就是Nrf2的激活，對(duì)于加強(qiáng)其調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性有著重要作用。目前研究認(rèn)為Nrf2/ARE通路在抵抗外來刺激以及抗氧化損傷方面起著重要作用[3，4]，Nrf2缺失或激活發(fā)生障礙都會(huì)使機(jī)體在抗氧化損傷方面的作用大大減弱，所以Nrf2-ARE通路對(duì)于機(jī)體的作用不言而喻。

運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激程度提高，尤其是其線粒體的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生會(huì)大大增加。雖然已經(jīng)知道Nrf2/ARE是抗氧化應(yīng)激的一個(gè)信號(hào)通路，而且已有研究表明線粒體ROS產(chǎn)生能夠激活Nrf2系統(tǒng)，但是在具體的運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激與Nrf2信號(hào)通路關(guān)系如何尚不是很明確，需要進(jìn)一步探討。本研究利用培養(yǎng)的小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞（C2C12）作為細(xì)胞模型，以電刺激引起其收縮，觀察模擬運(yùn)動(dòng)對(duì)C2C12細(xì)胞肌管自由基及Nrf2信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)及分化

C2C12細(xì)胞（小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞細(xì)胞株），購自南方醫(yī)科大學(xué)解剖教研室。將液氮中保存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，以2×105/mL密度種到6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞單層覆蓋培養(yǎng)板底面密度達(dá)95%左右時(shí)，換成分化培養(yǎng)液（高糖DMEM，2%馬血清，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素/鏈霉素）開始進(jìn)行分化培養(yǎng)，每天換液，并從加入分化培養(yǎng)基開始計(jì)算分化天數(shù)，分化6天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

C2C12細(xì)胞分化6天后分為對(duì)照組和電刺激組，對(duì)照組不進(jìn)行電刺激，直接收樣。電刺激組采用45 V、20 ms、5 Hz的刺激強(qiáng)度對(duì)肌管進(jìn)行電刺激，根據(jù)刺激時(shí)間分為 30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、120 min、和150 min七組，每組刺激后即刻收集細(xì)胞。

1.3 C2C12肌管培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）的測定

采用南京建成生物工程研究所提供的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒測定細(xì)胞膜完整性，440 nm波長處測光密度值，通過公式計(jì)算各組LDH濃度。

1.4 C2C12肌管活性氧（ROS）含量測定

利用熒光探針二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH—DA）進(jìn)行ROS檢測。采用原位裝載探針的方法，在37qc細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，然后電刺激和激光處理，用熒光分光光度計(jì)檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長522 nm。試劑由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.5 C2C12肌管內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的測定

在熒光酶標(biāo)儀波長為440 nm，溫度為25℃下，利用總谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的檢測試劑盒檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶 活 力 =[A340/min（sapmle）-A340/min（blank）]/0.00622。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒，在熒光酶標(biāo)儀波長為540～595 nm下進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。計(jì)算公式：樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力＝檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力×稀釋倍數(shù)/樣品中的蛋白濃度。試劑盒均由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.6 C2C12肌管Nrf2核蛋白含量的測定

收集細(xì)胞，離心提取蛋白。按照Nrf2核蛋白檢測試劑盒說明書和檢測目的條帶大小來配制一定濃度的分離膠和5%濃縮膠。一抗：Nrf2（博士德），1∶400稀釋，二抗：羊抗兔二抗（博士德）1∶200稀釋，之后進(jìn)行孵育，TBST洗滌膜。使用ECL試劑盒發(fā)光，顯影，X線膠片壓片曝光，掃描定量各條帶的相對(duì)灰度值，β-actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白相對(duì)含量=目的蛋白灰度值/βactin內(nèi)參蛋白灰度值。試劑盒由南京建成生物技術(shù)有限公司提供。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

研究數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并用單因素方差分析進(jìn)行各組間的差異顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同電刺激時(shí)間引起C2C12培養(yǎng)液中LDH活性的變化

如表1所示，電刺激分化6天的C2C12肌管，電刺激各組溶液中的LDH活性較對(duì)照組有少量的增加，但它們之間并無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 不同電刺激時(shí)間C2C12肌管LDH活性（U/L）

2.2 不同電刺激時(shí)間引起C2C12肌管ROS含量的變化

由表2可見，電刺激分化6天的肌管，細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，峰值分別出現(xiàn)在刺激60 min和120 min時(shí)；電刺激組除30 min、150 min組外，其他組與對(duì)照組相比，ROS含量都顯著升高（P＜0.05），其中60 min、120 min組與對(duì)照組相比有極顯著性升高（P＜0.01）。

表2 不同電刺激時(shí)間C2C12肌管ROS含量

2.3 不同電刺激時(shí)間引起C2C12肌管GSH-Px活性的變化

由表3可見，電刺激分化6天的C2C12肌管，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性變化呈增加趨勢，與對(duì)照組相比，60 min、90 min、120 min組均有顯著性升高（P＜0.05），75 min、150 min組有極顯著性升高（P＜0.01）。150 min組與75 min組相比有顯著性升高（P＜0.05）。

表3 不同電刺激時(shí)間C2C12肌管GSH-Px活性（mU/mg）

2.4 不同電刺激時(shí)間引起C2C12肌管Nrf2核蛋白含量的變化

由表4可見，電刺激分化6天的肌管，細(xì)胞內(nèi)Nrf2核蛋白生成的變化成增加趨勢，與對(duì)照組相比，60 min、90 min、120 min組有顯著性升高（P＜0.05），75 min、150 min組均有極顯著性升高（P＜0.01）。150 min與75 min組相比有顯著性升高（P＜0.05）。

表4 不同電刺激時(shí)間C2C12肌管Nrf2核蛋白含量（灰度值）

3 討論

3.1 C2C12肌管刺激強(qiáng)度及培養(yǎng)時(shí)間的確定

LDH是機(jī)體糖酵解供能系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，可以催化丙酮酸加氫生成乳酸。在有氧條件下，LDH可以將乳酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，再經(jīng)三羧酸循環(huán)徹底氧化，釋放能量供細(xì)胞代謝活動(dòng)；而在無氧條件下，LDH催化丙酮酸還原成乳酸進(jìn)而完成葡萄糖的無氧酵解過程，并且同時(shí)會(huì)釋放少量ATP為機(jī)體提供能量。LDH在大部分組織中都會(huì)存在，其中以肝、骨骼肌、腎臟、心肌和胰腺中較多，而且組織中的LDH的活性一般比較高。當(dāng)有細(xì)胞或者組織損傷時(shí)，該酶便會(huì)釋放進(jìn)而使其他血液或培養(yǎng)基中的LDH活性升高，所以電刺激后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性強(qiáng)弱能反映細(xì)胞的損傷程度。

邱國榮[5]采用刺激強(qiáng)度為45 V、20 ms、5 Hz，刺激時(shí)間分別為45、60、75、90、120 min，刺激細(xì)胞后，經(jīng)過蛋白總量的測定發(fā)現(xiàn)，分化前3天的肌管總蛋白增加明顯，且分化第2天和第3天的肌管蛋白總量都比前一天有明顯增加（P＜0.05），從第3天到第6天肌管中總蛋白含量保持穩(wěn)定，且比第1天有顯著性增加。說明從第3天開始蛋白合成與分解達(dá)到平衡，蛋白總量開始保持穩(wěn)定。此時(shí)肌管已有肌纖維的典型特征，與骨骼肌有相似的收縮功能，因此選擇分化6天的肌管作為試驗(yàn)對(duì)象。本研究采用45 V、20 ms、5 Hz的強(qiáng)度電刺激C2C12肌管30、45、60、75、90、120、150 min，本研究中電刺激 30、45、60、75、90、120、150 min 培養(yǎng)液中LDH活性與對(duì)照組相比有稍微升高，但并無顯著差異（P＞0.05），說明本研究中使用電刺激的強(qiáng)度和時(shí)間并沒有引起大量細(xì)胞的細(xì)胞膜破損，可以采用此電刺激強(qiáng)度和時(shí)間來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 不同電刺激時(shí)間對(duì)C2C12肌管ROS含量的影響

研究表明電刺激的頻率與電刺激時(shí)間的長短對(duì)于ROS的產(chǎn)生有著很大影響。Leonardo R.Silveira等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用不同的刺激強(qiáng)度刺激骨骼肌細(xì)胞，在高強(qiáng)度組，無論是細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外，ROS與對(duì)照組相比都有明顯升高，而在中等強(qiáng)度組，ROS與對(duì)照組相比則沒有顯著性變化，說明細(xì)胞狀態(tài)在中等強(qiáng)度組相對(duì)穩(wěn)定。Isabella Irrcher[6]等通過研究發(fā)現(xiàn)，電刺激頻率增加后，細(xì)胞內(nèi)線粒體活性會(huì)有顯著性增加，同時(shí)自由基導(dǎo)致的過氧化氫的量也會(huì)顯著性增加。McArdle A等[23]在研究ROS釋放的時(shí)程規(guī)律時(shí)，用刺激強(qiáng)度為2 ms、1 Hz、30 V的電刺激，作用于分化6天的大鼠衛(wèi)星細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)電刺激15min時(shí)，體內(nèi)的ROS便會(huì)快速升高。對(duì)于運(yùn)動(dòng)中線粒體自由基生成增多的原因，現(xiàn)在一般都認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)時(shí)氧化代謝較平時(shí)加快，進(jìn)而促進(jìn)了呼吸鏈產(chǎn)生更多的自由基。

本研究發(fā)現(xiàn)，除去30 min、150 min組，其余電刺激組的ROS量與對(duì)照組相比都有顯著性增加（P＜0.05），而且ROS的變化趨勢成雙峰曲線，這主要是由于運(yùn)動(dòng)引起的線粒體氧耗變化產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和細(xì)胞自身抗氧化系統(tǒng)之間的相互作用而產(chǎn)生的[7]。電刺激60 min時(shí)ROS到達(dá)一個(gè)峰值，說明此時(shí)骨骼肌運(yùn)動(dòng)氧耗增加，氧化應(yīng)激水平比較高而體內(nèi)自身的抗氧化系統(tǒng)卻還沒有充分調(diào)動(dòng)起來，隨著電刺激時(shí)間的延長，抗氧化系統(tǒng)也逐步地發(fā)揮作用，開始清除過多的ROS，到75 min時(shí)ROS生成量迅速降低；在刺激到120 min時(shí)又出現(xiàn)ROS峰值，這是由于機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)能力的提高跟不上自由基產(chǎn)生的增多，也就是說機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)清除自由基的能力逐漸小于自由基生成的能力[8]，所以使得ROS再次出現(xiàn)峰值。而在本研究中，繼續(xù)延長肌管收縮時(shí)間到150 min時(shí)，ROS生成減少，是因?yàn)榇藭r(shí)Nrf2信號(hào)系統(tǒng)被進(jìn)一步激活，Nrf2核蛋白含量和GSH-Px活性都比較高，抗氧能力強(qiáng)，使ROS下降，也可能與此時(shí)細(xì)胞的收縮能力減弱有關(guān)。

3.3 不同電刺激時(shí)間對(duì)C2C12肌管GSH-Px活性的影響

研究表明GSH-Px不但是在自身免疫方面對(duì)機(jī)體有著重要的作用，而且它還可以充當(dāng)免疫增強(qiáng)劑和抗氧化劑，此外它還可以控制自由基代謝增強(qiáng)[9]。相關(guān)研究表明，在劇烈的運(yùn)動(dòng)后由于自由基生成過多，會(huì)使得機(jī)體內(nèi)部組織發(fā)生損傷，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)于提高GSH-Px的活性有很大幫助，所以通過訓(xùn)練來降低運(yùn)動(dòng)后的肌肉組織損傷是一個(gè)很好的選擇，對(duì)機(jī)體而言也是非常有益的[10]。有實(shí)驗(yàn)通過比較急性劇烈運(yùn)動(dòng)和游泳訓(xùn)練，來檢測這兩種運(yùn)動(dòng)中骨骼肌和平滑肌的GSH-Px含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)游泳組GSH含量比劇烈運(yùn)動(dòng)組明顯升高，機(jī)體的免疫力也上升了[11]，而且體內(nèi)的GSH-Px一般都是通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力[12，13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，電刺激30 min到45 min時(shí)，肌管內(nèi)的GSH-Px與對(duì)照組相比，雖有少量增加但并無顯著性差異（P＞0.05），可能是因?yàn)閯傞_始體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)剛剛啟動(dòng)，GSH-Px沒有被完全激活。GSH-Px的活性在60 min刺激時(shí)就開始有顯著性增加，且一直呈升高趨勢，到75 min時(shí)與對(duì)照組相比有極顯著性升高（P＜0.01）。表明此時(shí)電刺激引起C2C12收縮，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化機(jī)制被激活，Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)了調(diào)控GSHPx的基因，以消除產(chǎn)生過多的ROS。90 min和120 min時(shí)GSH-Px的活性略有下降的原因可能是此時(shí)自由基的生成能力還比較高，對(duì)GSH-Px的活性有一定的抑制作用。到了150 min時(shí)GSH-Px的活性與75 min相比有顯著性升高，原因是此時(shí)Nrf2核蛋白含量比較高，那么受其調(diào)控的下游的GSH-Px基因會(huì)被大量的激活，從而使GSH-Px的活性升高，同時(shí)也與此時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS量下降的變化相符。

3.4 不同電刺激時(shí)間對(duì)C2C12肌管Nrf2核蛋白含量的影響

Nrf2/ARE被激活后能夠啟動(dòng)下游多種保護(hù)性基因的表達(dá)，所以對(duì)于它的研究向來都比較重要。到迄今為止，我們發(fā)現(xiàn)受Nrf2激活調(diào)控的基因有差不多200個(gè)左右，而且在不同條件下可以激活不同的激活物，這其中也跟激活方式有一定的關(guān)系[14]。Tan等研究發(fā)現(xiàn)無論肌細(xì)胞在體內(nèi)還是體外，當(dāng)其處于糖尿病環(huán)境下時(shí)，通過細(xì)胞外相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)相應(yīng)的激酶從而下調(diào)Nrf2的功能，使細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)胰島素抵抗，使患者心肌的葡萄糖利用率降低[15，16]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是好多疾病的發(fā)病機(jī)制，比如創(chuàng)傷性腦損傷、缺血性腦卒中等，有研究證實(shí)，當(dāng)這些疾病發(fā)生時(shí)，Nrf2及其下游的相關(guān)抗氧化酶和解毒酶的活性與比正常時(shí)有顯著性增加[17-19]，這說明了Nrf2可能是相關(guān)腦損傷疾病的內(nèi)在性機(jī)制。另外也有研究表明用H2O2刺激大鼠肝臟細(xì)胞前，再給予大鼠一定濃度的白藜蘆醇培養(yǎng)一段時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非治療組中只有細(xì)胞質(zhì)中有Nrf2的表達(dá)，而治療組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有Nrf2的表達(dá)[20]，說明治療組中Nrf2發(fā)生了核轉(zhuǎn)移。

電刺激30 min、45 min時(shí)，肌管內(nèi)的Nrf2核蛋白含量與對(duì)照組相比，雖有少量增加但并無顯著性差異（P＞0.05），可能是因?yàn)镽OS的堆積量還沒達(dá)到可以激活Nrf2的水平。60 min時(shí)Nrf2核蛋白含量與對(duì)照組相比有顯著增加（P＜0.05），75 min達(dá)到一個(gè)峰值，與對(duì)照組比較有極顯著升高（P＜0.01），說明此時(shí)Nrf2信號(hào)系統(tǒng)已被激活，進(jìn)而激活GSH-Px的活性，使它們發(fā)揮抗氧化作用，使ROS下降。150 min時(shí)與75 min相比Nrf2核蛋白含量有顯著性升高（P＜0.05），其原因可能是由于長時(shí)間的刺激，使細(xì)胞本身的收縮能力減弱，那么其產(chǎn)生的ROS的能力也會(huì)受到影響，同時(shí)氧化應(yīng)激也會(huì)減弱，那么抗氧化系統(tǒng)在與氧化應(yīng)激相互制約當(dāng)中，抗氧化系統(tǒng)會(huì)占據(jù)上風(fēng)，使得Nrf2系統(tǒng)被進(jìn)一步的激活，Nrf2核蛋白含量則會(huì)相應(yīng)的增加，同時(shí)也與此時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS量的下降變化相符。

3.5 在不同電刺激時(shí)間下，C2C12肌管內(nèi)GSH-Px和Nrf2核蛋白含量的對(duì)比研究

隨著電刺激時(shí)間的增加，C2C12肌管內(nèi)GSH-Px活性和Nrf2核蛋白含量的變化趨勢基本一致，從0 min到75 min時(shí)間段內(nèi)呈上升趨勢并達(dá)到一個(gè)高峰，而此時(shí)75 min組的ROS剛剛處于最低谷，這是因?yàn)殡姶碳ぎa(chǎn)生的ROS會(huì)使正常情況下和Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合在一起的Keap1發(fā)生了構(gòu)象變化，進(jìn)而導(dǎo)致Nrf2與Keap1的解離，使得Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，并在核內(nèi)與Maf蛋白結(jié)合生成異源二聚體同時(shí)與ARE結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)其下游相關(guān)抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，如超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、醌氧化還原酶 1（quinine oxidoreductase1，NQO1）、血紅素加氧酶1（hemeoxygenase1，HO-1）、和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等[21]。75 min到150 min時(shí)間段內(nèi)GSH-Px活性和Nrf2核蛋白含量同時(shí)有一個(gè)小幅度降低，緊接著又呈升高趨勢，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)的ROS又繼續(xù)升高，使得體內(nèi)的氧化系統(tǒng)相對(duì)于抗氧化系統(tǒng)略占優(yōu)勢。不過隨著時(shí)間的增加，我們看到150 min時(shí)Nrf2核蛋白繼續(xù)升高，這一優(yōu)勢逐漸被消除，這可能是此時(shí)Nrf2下游其他抗氧化酶基因陸續(xù)被激活的原因，如SOD、NQO1和HO-1等。

4 結(jié)論

在45V、20 ms、5 Hz的強(qiáng)度下，電刺激C2C12肌管會(huì)使肌管發(fā)生氧化應(yīng)激，結(jié)合ROS產(chǎn)生量隨電刺激時(shí)間的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)ROS只有達(dá)到一定的量才能激活Nrf2信號(hào)系統(tǒng)，同時(shí)啟動(dòng)相關(guān)基因，使GSH-Px發(fā)揮抗氧化作用，而且隨著刺激時(shí)間的增加，肌管內(nèi)抗氧化能力略有降低，隨后則繼續(xù)保持著其較高的活性。這對(duì)于我們以后在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練過程中合理安排訓(xùn)練時(shí)間、休息時(shí)間、提高機(jī)體抗氧化能力和防止氧化應(yīng)激方面有著一定參考意義。